内毒素在磨损颗粒刺激巨噬细胞产生炎症和凋亡中的作用研究

摘要

研究背景：
　　磨损颗粒被认为在骨溶解的发生和发展中起着关键性作用。磨损颗粒会激活巨噬细胞产生各种促炎症因子（IL-1，11-6，TNF-α），从而导致一系列级联反应，最终导致假体无菌性松动的发生。然而最近一系列的研究发现，完全去除内毒素的磨损颗粒（包括金属颗粒，聚乙烯颗粒，骨水泥颗粒）均不能诱导巨噬细胞产生炎症因子。由此可见，磨损颗粒刺激巨噬细胞产生炎症因子的经典无菌性松动理论还有待探讨。内毒素与人类许多疾病的发生发展密切相关。但内毒素在磨损颗粒刺激巨噬细胞产生炎症和凋亡中的作用至今都不是很清楚，本文试图做一解释。
　　目的：
　　1.比较磨损颗粒内毒素的不同清除方法和内毒素检测方法对磨损颗粒诱发炎症因子的影响。
　　2.以含内毒素的钛颗粒模拟松动假体周围的亚临床感染，在体外刺激巨噬细胞，观察其凋亡情况。
　　3.含或不含内毒素的磨损颗粒刺激巨噬细胞产生炎性因子的体内外比较，观察钛颗粒在体内外的不同炎性反应。
　　4.去除内毒素的磨损颗粒在体内产生炎症因子的机制研究。
　　方法：
　　1.使用三种方法清除内毒素，比较其清除能力以及对巨噬细胞的生物学影响。
　　2.使用含或不含内毒素钛颗粒，分别刺激巨噬细胞，观察钛颗粒和内毒素对巨噬细胞的细胞毒性作用和凋亡作用。
　　3.运用ELISA和RealtimePCR反应来证实(1)含有内毒素的磨损颗粒是否能被巨噬细胞清除内毒素，(2)不含内毒素的磨损颗粒是否在体内能刺激巨噬细胞产生炎性因子。
　　4.观察:(1)内毒素和磨损颗粒粘附性。(2)人体正常水平内毒素的浓度是否足以激活假体周围由于磨损颗粒的产生而聚集的巨噬细胞？(3)体内内毒素水平的升高是否也会影响假体周围巨噬细胞的炎症反应？
　　结果：
　　1.强酸强碱反复处理，去除内毒素的方法最好;去除钛颗粒表面内毒素后，几乎不能诱导巨噬细胞产生炎性因子。
　　2.随着去除内毒素的钛颗粒浓度的增加，其对巨噬细胞的毒性和凋亡作用亦增加;而内毒素在钛颗粒低浓度时无明显影响，在钛颗粒高浓度时明显增强钛颗粒对巨噬细胞的毒性和凋亡作用;含内毒素的高浓度钛颗粒其致凋亡途径可能是由升高的NO和TNF-α引起的。
　　3.体外实验表明，无论含或不含内毒素，经巨噬细胞吞噬后，最终都无法诱导巨噬细胞产生炎症因子。体内实验表明，含或不含内毒素钛颗粒诱导体内巨噬细胞产生炎性因子时仅在早期存在差异，后期没有差异。但不含内毒素的钛颗粒气囊与空白囊相比，确实存在比较多的炎性因子。
　　4.钛颗粒和内毒素在体外没有很强的黏附性;生理水平的内毒素足以刺激巨噬细胞产生炎性反应;在相同生理水平的内毒素情况下，局部聚集的巨噬细胞越多，其产生的炎症水平也相对越高;体内内毒素有很强的穿透性，可异位影响远处聚集的巨噬细胞产生炎性因子。
　　结论：
　　1.在使用磨损颗粒做炎症研究时，必须使用正确的内毒素去除和检测方法，不然会导致研究结果不可信。
　　2.亚临床感染和磨损颗粒共同作用可能是无菌性松动假体周围巨噬细胞凋亡的真正原因。
　　3.不含内毒素的磨损颗粒在体内也能诱发巨噬细胞产生炎性因子。
　　4.内毒素在磨损颗粒刺激巨噬细胞产生炎症因子的过程中可能扮演了重要角色。

目录

声明

摘要

缩略词说明

绪论

第一部分 内毒素清除和检测方法对磨损颗粒诱发炎症因子的影响

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 主要仪器和试剂材料

1．2．2 磨损颗粒准备

1．2．3 钛颗粒的形态学、化学组成检测和颗粒大小测量

1．2．4 磨损颗粒内毒素检测

1．2．5 巨噬细胞系的获得和培养

1．2．6 细胞活力分析：MTT

1．2．7 ELISA法检测巨噬细胞炎性细胞因子的表达

1．2．8 NF-κB荧光素酶基因报告实验

1．2．9 数据统计分析

1．3 结果

1．3．1 不同去除内毒素的方法没有改变钛颗粒的形态、大小和化学组成

1．3．2 仅仅使用上清检测会得到内毒素检测阴性结果

1．3．3 不同方法去除内毒素的钛颗粒对巨噬细胞的细胞毒性无差异

1．3．4 钛颗粒所含的内毒素能刺激巨噬细胞产生炎性反应并激活转录因子NF-κB

1．4 讨论

1．5 本部分结论

本部分附图

参考文献

第二部分 含或不含内毒素的钛颗粒对巨噬细胞的毒性和凋亡比较

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 主要仪器和试剂材料

2．2．2 磨损颗粒准备和内毒素的检测

2．2．3 巨噬细胞培养

2．2．4 细胞活力分析：MTT

2．2．5 流式细胞定量检测巨噬细胞凋亡

2．2．6 TUNEL方法观察巨噬细胞凋亡

2．2．7 NO和TNF-α检测

2．2．8 数据统计分析

2．3 结果

2．3．1 高浓度的含内毒素钛颗粒具有较强的细胞毒性

2．3．2 高浓度的含内毒素钛颗粒具有较强的致凋亡作用

2．3．3 高浓度的含内毒素钛颗粒具有较强的致凋亡作用可能是由NO和TNF-α的增高引起的

2．4 讨论

2．5 本部分结论

本部分附图

参考文献

第三部分 含或不含内毒素的磨损颗粒刺激巨噬细胞产生炎性因子的体内外比较

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要仪器和试剂材料

3．2．2 磨损颗粒准备和内毒素的检测

3．2．3 体外实验

3．2．4 体内实验

3．2．5 数据统计分析

3．3 结果

3．3．1 有无内毒素的钛颗粒体外炎症因子比较

3．3．2 有无内毒素的钛颗粒体内炎症因子比较

3．4 讨论

3．5 本部分结论

第三部分附图

参考文献

第四部分 去除内毒素的磨损颗粒在体内产生炎症因子的机制研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要仪器和试剂材料

4．2．2 磨损颗粒准备和内毒素的检测

4．2．3 内毒素和钛颗粒的黏附性观察

4．2．4 不同浓度内毒素对巨噬细胞的炎性影响

4．2．5 同一生理水平的内毒素浓度下对不同数量巨噬细胞的炎性影响

4．2．6 异位内毒素注射能否穿越血管，影响异位聚集的巨噬细胞

4．2．8 数据统计分析

4．3 结果

4．3．1 内毒素和钛颗粒的粘附性性观察

4．3．2 不同浓度内毒素对巨噬细胞的炎性影响

4．3．3 同一生理水平的内毒素浓度下对不同数量巨噬细胞的炎性影响

4．3．4 异位内毒素注射能穿越血管，影响异位聚集的巨噬细胞

4．4 讨论

4．5 本部分结论

本部分附图

参考文献

第五部分 全文总结与展望

5．1 全文总结

5．2 本文的主要贡献和创新点

5．3 今后研究工作展望

致谢

攻渎博士学位期间发表文章、基金申请与获奖情况