HBV相关慢加急性肝衰竭患者T淋巴细胞和单核细胞功能障碍的研究

摘要

第一部分 HBV相关慢加急性肝衰竭患者外周血CD4+调节性T细胞与传统T细胞失衡的研究
　　目的：近年来，慢加急性肝衰竭（ACLF）患者免疫功能障碍，尤其是固有免疫功能障碍的病理生理作用得到了广泛研究，然而在适应性免疫失调方面的研究仍较缺乏。本研究有三个目的：1）评定乙型病毒性肝炎（HBV）相关ACLF患者外周血CD3+T淋巴细胞的数目改变；2）探讨外周血CD4+调节性T细胞（Tregs）与传统T细胞（Tconv）之间的平衡问题，并进一步分析Tregs亚群比例的变化；3）评估CD4+Tregs及其各亚群的免疫抑制能力。
　　方法：从2011年8月至2013年3月收集20例HBV相关ACLF患者入院后首次留取的外周血标本，同期纳入10例脓毒血症休克患者、20例慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者和20名健康志愿者作为对照组。应用流式细胞术，我们进行外周血CD3+T细胞及其亚群的绝对数量检测、CD4+Tregs的表型染色（表面分子CD25和CD45RA）和CD4+T细胞胞内FoxP3和IL-17染色。最后，应用CFSE染色测定CD4+Tregs及其各亚群在体外对Tconv增殖的抑制能力。
　　结果：与健康对照组（HC）和 CHB组相比，HBV相关 ACLF组和脓毒血症休克组患者外周血 CD3+ T及 CD3+CD4+ T和CD3+CD8+T细胞的数目均显著减少，且两组之间没有明显差异；其中，CD4+Tregs的数量没有改变而Tconv的数目显著减少，使得CD4+Tregs与Tconv的比例明显升高，且脓毒血症休克组高于HBV相关ACLF组。此外，HBV相关ACLF组CD4+Tregs与Th17的比值高于HC组和CHB组。对Tregs进行亚群分析，我们发现HBV相关ACLF组Treg-Ⅱ and-Ⅲ亚群占CD4+T细胞的比例显著高于对照组，但是Treg-Ⅰ与HC组相比无明显差异。体外功能试验显示，HBV相关ACLF患者整群CD4+Tregs的体外抑制功能与HC和CHB组相比无明显差异，但各亚群的抑制能力各不相同，Treg-Ⅱ最强，Treg-Ⅰ次之，Treg-Ⅲ最弱。
　　结论：同脓毒血症休克组类似，HBV相关ACLF患者外周血CD4+T淋巴细胞发生明显耗竭，且以Tconv的耗竭为主；发挥免疫负调作用的CD4+Tregs与Tconv的平衡被打破，前者明显占优势。正如脓毒血症休克中报道，这种失衡很可能在HBV相关ACLF的适应性免疫功能障碍中发挥了重要的作用。
　　第二部分 HBV相关慢加急性肝衰竭患者外周血单核细胞吞噬功能障碍的研究
　　目的：单核细胞功能障碍是慢加急性肝衰竭（ACLF）患者发生免疫功能紊乱的一个重要特征，主要表现为单核细胞表面人类白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达下调，分泌促炎性细胞因子的水平下降、分泌抑炎性细胞因子的水平升高。本文旨在探讨乙型肝炎病毒（HBV）相关 ACLF患者外周血单核细胞吞噬功能的变化和可能的机制及与临床预后的相关性。
　　方法：自2011年9月至2013年1月收集15例HBV相关ACLF患者外周血标本，同期纳入12例慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者和20例健康志愿者（HC）作为对照组；同时，根据患者病情的转归将ACLF患者进一步分为好转组（7例）和未好转组（8例）。利用流式细胞术进行外周血单核细胞的表型染色，并进行了体外吞噬试验检测单核细胞的吞噬能力。
　　结果：与HC和CHB组相比，HBV相关ACLF患者外周血单核细胞吞噬beads的百分比[beads(+)％]显著降低；beads-FITC的几何平均荧光强度（GMFI）略低于HC组，但无统计学差异。HBV相关ACLF组单核细胞表面程序性细胞死亡-1（PD-1）分子表达明显高于HC和CHB组；加入PD-1阻断抗体后，ACLF患者外周血整群单核细胞beads(+)%和GMFI均明显回升。对单核细胞进行亚群分析发现，HBV相关ACLF患者CD14+CD16-(Mo1)亚群的beads(+)%显著低于对照组；其中一群新的CD14lowCD16-单核亚群（Mo0）的beads(+)%明显低于同组经典的CD14highCD16-(Mo1’)单核亚群和HC组、CHB组的经典Mo1（CD14+CD16-）亚群。此外，我们发现HBV相关ACLF未好转组外周血单核细胞的beads(+)%显著低于好转组。
　　结论：外周血单核细胞吞噬功能障碍是HBV相关ACLF患者免疫紊乱的一个重要特征，尤以新亚群Mo0和经典Mo1’的吞噬能力障碍为主；PD-1阻断后可以明显逆转单核细胞的吞噬功能障碍，因此抗PD-1抗体有望成为缓解HBV相关ACLF免疫抑制状态的有效策略。单核细胞吞噬功能的下降程度与患者预后密切相关，这对临床早期的预后判断具有重要的意义。

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第一部分HBV相关慢加急性肝衰竭患者外周血CD4+调节性T与传统T淋巴细胞失衡的研究

引言

对象和方法

结果

讨论

结论

第二部分HBV相关慢加急性肝衰竭患者外周血单核细胞吞噬功能障碍的研究

引言

对象和方法

结果

讨论

结论

全文总结

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