先心病肺动脉高压生物标记物筛选和动物模型构建

摘要

目的：肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）的常见并发症，CHD重度PAH术后部分患者肺动脉压力仍维持在较高水平，甚至继续升高，严重影响了患者的生活质量，然而目前的临床检查手段难以区分肺血管病变是否可逆。本课题拟通过microRNA芯片技术，比较CHD术后可逆性PAH和不可逆PAH（irreversible PAH，iPAH）患者血浆中microRNA的表达谱，旨在发现能够区别PAH和 iPAH的特异性的 microRNA。同时我们拟构建小鼠腹腔分流型重度PAH模型，为进一步深入研究重度PAH提供平台。
　　方法：以2011年10月1日－2012年9月30日在上海儿童医学中心就诊的CHD重度PAH患者为研究对象。根据治疗后6月患者随访的平均肺动脉压力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）将患者分为3组：mPAP≥50 mmHg为iPAH组，25mmHg≤mPAP≤50 mmHg为可逆性PAH组（简称为PAH组），mPAP＜25mmHg的CHD患者（治疗前mPAP＜25mmHg）为对照组。其中10例患者（对照组3例，PAH组3例，iPAH组4例）的血浆标本通过microRNA芯片技术筛选，30例患者（对照组12例，PAH组10例，iPAH组8例）的血浆标本进行microRNA芯片结果的验证。
　　将雄性C57/BL6小鼠随机分为传统针扎小分流组(n=32)，其中4周末组、6周末组、8周末组、12周末组各8只；间隔剪开大分流组(n=32)，其中4周末组、6周末组、8周末组、12周末组各8只、假手术组(n=8)和正常对照组(n=8)。传统针扎小分流组采用注射针头进行造瘘，间隔剪开大分流组采用直接剪开腹主动脉下腔静脉间隔制作腹腔动静脉分流。传统针扎小分流组和间隔剪开大分流组4周末、6周末、8周末、12周组测小鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数，通过右心室收缩压评估肺动脉收缩压。通过HE染色和VG染色观察肺血管的形态学改变。用CD-31标记内皮细胞，α-SMA标记平滑肌细胞，通过免疫荧光技术观察重度PAH肺血管重构的特点。
　　结果：本课题通过microRNA芯片技术比较了CHD重度PAH患者血浆microRNA的表达，结果显示 iPAH组表达上调的microRNA有7个，分别为miR-301a-3p、miR-145、miR-126、miR-26a、miR-374a、miR-1、miR-34a，下调的有3个，miR-20b、miR-500a、miR-501-3p。我们选取了表达差异最显著的5个microRNA（miR-301a-3p、miR-145、miR-126、miR-26a、miR-374a）运用Real Time-PCR进行验证，结果与芯片结果基本相符合，其中iPAH组miR-145、miR-126、miR-374a的表达明显高于PAH组（p＜0.01，p=0.003，p=0.007）和正常组（p＜0.05）。iPAH组miR-145、miR-126的表达倍数比PAH高2倍。
　　我们运用腹腔分流法成功建立了小鼠重度PAH模型。间隔剪开大分流组的分流通畅率比传统针扎小分流组的通畅率明显提高(P<0.01)；间隔剪开大分流组小鼠肺动脉压力和右心室肥厚指数比其余各组均明显升高(P<0.05)；HE染色和 VG染色可观察到间隔剪开大分流组和传统针扎小分流组小鼠的平滑肌层明显增厚，平均中膜厚度百分比进行性减少，间隔剪开大分流组的平均中膜厚度百分比与其余各组均明显升高(P<0.01)。免疫荧光检测显示传统针扎小分流组肺血管平滑肌细胞增殖，间隔剪开大分流组肺血管平滑肌细胞增殖、内皮细胞增生，与临床重度PAH患者的肺血管重构相符。
　　结论：通过microRNA芯片筛选和进一步的验证，我们得出miR-145、miR-126可区分PAH和iPAH，并且可能跟重度PAH肺血管重构有着密切的关系。直接剪开腹主动脉下腔静脉间隔的方法建立小鼠PAH模型，可以建成与临床患者相符的重度PAH模型，为临床研究CHD合并重度PAH提供了稳定可靠的模型。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文索引

绪论

参考文献

第一部分：重度PAH患者血浆microRNA表达谱分析及初步验证

摘要

ABSTRACT

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：小鼠腹腔分流型PAH模型的构建

摘要

ABSTRACT

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

致谢

学位相关论文