丰富生存环境对小鼠肿瘤的抑制作用及其整合生物学研究

摘要

癌症是一种系统性疾病。癌症虽然表现为局部组织细胞的异常生长，但机体的神经、免疫和内分泌系统都伴有相应的改变，并对癌症的发生和发展起着重要的调控作用。
　　环境因素对肿瘤的发生发展的影响传统上局限于理化研究。作为一种良性应激，丰富生存环境（Enriched Environment，EE）被广泛用来研究环境对脑功能的影响，包括对正常动物模型以及各种中枢神经系统损伤模型的研究。关于丰富环境对肿瘤发生发展影响的研究，国内外鲜有报道。为此，本课题拟开展以下两方面的开拓性工作：
　　1.建立丰富生存环境饲养条件下的小鼠移植瘤模型，观察精神行为因素对小鼠肿瘤生长的影响作用；
　　2.在上述动物模型基础上，通过整合生物学研究，探索可能与丰富生存环境抑瘤作用相关的通路及机制。
　　第一部分丰富生存环境肿瘤小鼠模型的建立
　　目的：建立丰富生存环境饲养条件下的小鼠移植瘤模型，观察精神行为因素对小鼠肿瘤生长的影响作用。
　　方法：建立小鼠丰富生存环境及标准饲养环境。EE：在60cm×40cm×20 cm的透明大鼠笼内，铺覆垫料，设置小屋、斜梯、隧道、塑料跑轮、躲避处、棉花、各种形状及颜色的玩具,在小鼠浴室和厕所里分别撒放浴沙和鼠沙。每笼安置12只小鼠，每2～3d清洁并更换笼具及玩具。每周对小鼠进行称重并记录。小鼠标准饲养环境：于30cm×18 cm×25 cm的小鼠笼内，每笼4只小鼠，笼底铺设垫料。环境温度均保持21～23℃，维持12 h照明、12 h黑暗的光照周期，实验动物自由进食、饮水。
　　将C57BL/6雄性小鼠分别置于丰富生存环境和标准饲养环境下饲养3周，皮下接种Panc02胰腺癌、B16F10黑色素瘤和Lewis肺癌细胞，继续在原有环境饲养3-5周，肿瘤生长曲线。动物实验终止时，称量瘤重，计算抑瘤率，并保存小鼠血清、瘤体及各器官组织样本进行后续相关实验。选择C57BL/6雌性小鼠分别建立Panc02胰腺癌和B16F10黑色素瘤模型。选择BALB/c雄性小鼠建立CT-26及CT-26sci结肠癌模型。
　　结果：在C57BL/6雄性小鼠皮下移植瘤模型中，EE对Panc02胰腺癌、B16F10黑色素瘤和Lewis肺癌的抑瘤率分别为58.2％（EE组0.23±0.12g v.s.对照组0.55±0.14g， P<0.001）、43.1%（EE组2.01±2.11g v.s.对照组3.53±2.24g， P=0.05）及36.5%（EE组2.51±0.25g v.s.对照组3.95±0.26g，P<0.01）。免疫组化证实EE小鼠瘤体中PCNA表达较对照小鼠瘤体细胞显著下降，进一步提示了EE对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。
　　在C57BL/6雌性小鼠的Panc02胰腺癌模型中，EE组肿瘤大小与对照组无明显差异（EE组0.94±0.21 vs.对照组0.96±0.23g，P>0.05）。同样，在B16F10黑色素瘤模型中，EE对C57BL/6雌性小鼠的抑瘤作用也无显著意义（EE组1.28±0.27g vs.对照组1.53±0.25g，P=0.497），表明EE对肿瘤的抑制作用具有性别特异性。
　　在BALB/c雄性小鼠的CT26结肠癌模型，丰富环境组小鼠肿瘤重量与对照无显著差异（EE组3.67±1.14g vs.对照组3.16±1.02g，P=0.382）。同样，在BALB/c雄性小鼠的CT26-sci结肠癌模型中，丰富环境组小鼠肿瘤重量与对照组也无显著差异（EE组4.11±0.92g vs.对照组3.40±1.19g，P=0.105），表明EE的抑瘤作用受小鼠品系的影响。
　　为了探索运动、社交等因素是否为EE抑瘤的决定因素，我们设立了单纯运动组（常规饲养笼中加跑轮运动）、单纯社交组（12只小鼠置于没有玩具和运动器材的大笼中饲养）以及社交缺乏组（即2只小鼠置有玩具及运动器材的大笼中饲养），结果显示，社交缺乏组、单纯社交组及单纯运动组与对照组相比，抑瘤率分别为15.5%、17.4%和14.8%。表明EE环境对肿瘤的抑制作用是活动和社交综合作用的结果。
　　结论：丰富生存环境对雄性C57BL/6小鼠移植性肿瘤具有广泛且显著的抑制作用，该作用可能具有性别及种系差异。
　　胰腺癌的发生发展是多信号通路、多机制作用的结果。丰富生存环境可以显著抑制小鼠皮下抑制瘤的生长，其中以对Panc02胰腺癌皮下移植瘤的作用最为显著。为揭示其抑瘤机制，我们对肿瘤细胞进行基因组学及蛋白组学分析。对Panc02胰腺癌瘤体组织的基因水平和蛋白水平的深入研究，有助于阐明丰富生存环境与胰腺癌发生发展的关系，可能对胰腺癌防治提供思路和线索。
　　目的：采用小鼠全基因组表达谱及定量蛋白质谱检测对Panc02胰腺癌瘤体组织进行高通量基因表达及蛋白水平分析，用生物信息学方法探索丰富生存环境对Panc02胰腺癌瘤体生长的影响。
　　方法：抽提Panc02胰腺癌瘤体RNA及蛋白，采用Agilent Whole Genome Microarry4×44K小鼠全基因组表达谱芯片及iTRAQ标记蛋白质谱定量分析对Panc02胰腺癌瘤体组织分别进行小鼠全基因组表达谱分析及蛋白质谱检测，运用生物信息学软件GeneSpring11.5寻找差异基因及蛋白，并使用DAVID软件进行相应的基因本体学及通路分析。
　　结果：小鼠全基因组基因表达谱分析结果显示，在丰富生存环境条件下，Panc02胰腺癌组织在基因表达水平上发生了广泛而显著的变化，该变化以向下调节为主。基因本体分析显示Panc02胰腺癌组织在生物学过程的变化以粘附、发育、运动为主；细胞组分以细胞连接、细胞骨架及膜结构等为主；分子功能则以结合及分子活性为主。这些基因本体学条目均与肿瘤增殖、迁移、侵袭等特征密切相关，可能是丰富生存环境对肿瘤抑制作用的潜在机制。
　　对Panc02胰腺癌基因表达谱2倍以上差异基因的KEGG通路分析显示，在丰富生存环境条件下，Panc02胰腺癌组织不但在多条代谢通路上发生显著变化，同时在帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经精神疾病相关通路上也发生显著富集。对基因表达谱5倍以上差异基因的KEGG通路分析发现这些神经精神疾病相关通路富集在2倍到5倍差异基因区间。
　　对Panc02胰腺癌组织进行定量蛋白质谱检测，获得1.5倍以上差异蛋白1658个，其中上调1.5倍以上者242个，下调1.5倍以上者380个。进行KEGG通路分析发现，这些差异蛋白也在帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经精神疾病相关通路上发生显著富集。对基因表达谱2倍以上差异基因及1.5倍以上差异蛋白的进行交集分析后进一步确认，在丰富生存环境下Panc02胰腺癌组织在神经精神疾病相关通路上发生显著富集。
　　结论：在丰富生存环境条件下，Panc02胰腺癌瘤体中基因表达发生了广泛和显著的改变，且富集于帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经退行性变相关通路上。其是否为EE抑制肿瘤细胞生长的关键分子和核心机制，值得深入探讨。
　　第三部分丰富生存环境对神经-内分泌系统的生物信息学研究
　　丰富生存环境的本质是一种良性应激，其作用的发挥必然涉及神经系统调控及应激反应。丰富生存环境抗肿瘤作用可能涉及一系列的神经内分泌调控，这项多脏器、多系统的复杂工程需通过系统生物学研究方能全面揭示。
　　目的：对丰富生存环境与标准饲养环境的未荷瘤及短期荷瘤刺激小鼠海马、下丘脑-垂体-肾上腺轴进行全基因组基因表达谱芯片分析，运用生物信息学方法探索在丰富生存环境下脑部如何影响肿瘤的生长。
　　方法：建立丰富生存环境及标准饲养环境。分别获得未荷瘤 C57BL/6雄性小鼠和接受短期肿瘤刺激的C57BL/6小鼠的海马、下丘脑、垂体、肾上腺。抽提总RNA后进一步纯化进行小鼠全基因组表达谱芯片检测。对海马表达谱芯片结果进行差异基因筛选、基因本体学及 KEGG通路分析。对荷瘤小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴表达谱芯片采用基因及富集分析。
　　结果：对海马基因表达谱芯片分析发现，在丰富生存环境下未荷瘤小鼠及荷瘤小鼠海马基因表达谱均发生显著变化。在丰富生存环境下，荷瘤小鼠与未荷瘤小鼠的共同上调基因富集在神经活性配体受体交互作用通路，而共同下调基因富集在G蛋白偶联信号通路上。在丰富生存环境下，荷瘤小鼠海马共有520个基因的mRNA发生了2倍以上的改变，其中上调基因224个，下调基因296个。在224个上调基因中，有198个基因在未荷瘤小鼠中不受EE的诱导，提示他们可能特异性地与EE的抗肿瘤作用有关。KEGG分析显示，这198个基因主要涉及ErbB signaling pathway和Adherens junction通路；在296个下调基因中，同样有264个基因在未荷瘤小鼠中不受EE的诱导而改变，它们主要富集在Vascular smooth muscle contraction通路。脑源性神经营养因子（BDNF）是以往报道较多的在EE环境中显著上调的一种蛋白，因此我们在芯片结果中重点观察了该蛋白在海马中的改变规律。与非荷瘤标准环境相比，非荷瘤丰富生存环境、荷瘤标准环境、荷瘤丰富生存环境海马BDNF的表达倍数分别为1.80、2.17、2.57倍，提示BDNF可能介导大脑对EE反应后的抗肿瘤效应。
　　对未荷瘤小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴基因表达谱的基因本体及 KEGG通路分析发现，下丘脑-垂体-肾上腺轴腺体发育、分泌等条目及神经活性配体-受体交互作用通路在丰富生存环境下显著富集。
　　基因集富集分析显示，在丰富生存环境条件下，HPA轴基因表达谱在165个KEGG基因集中有52个发生上调，其中3条基因集FDR小于25%，涉及鞘糖脂合成、糖基磷脂酰肌醇合成及基础转录；而在标准饲养环境组，HPA轴基因表达谱在165个基因集中有113个发生上调，其中6条基因集FDR小于25%，与细胞分裂、同源重组、RNA聚合酶等通路有关。
　　结论：丰富生存环境下荷瘤及未荷瘤小鼠海马的BDNF的基因表达水平均显著增高，提示海马可能通过BDNF参与丰富生存环境对肿瘤的抑制作用调控。
　　丰富生存环境下，海马、下丘脑、垂体、肾上腺均在神经活性配体受体交互作用通路上富集，提示该通路是丰富生存环境抑制肿瘤发生发展的可能途径。
　　荷瘤状态下，丰富生存环境小鼠下丘脑-垂体-肾上腺在鞘糖脂合成、糖基磷脂酰肌醇合成及基础转录通路上显著富集。

目录

声明

第一部分 丰富生存环境肿瘤小鼠模型的建立

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨 论

5.小结

参 考 文 献

第二部分 丰富生存环境对Panc02胰腺癌生长影响的基因表达谱芯片及定量蛋白质谱分析

1. 引 言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨 论

5. 小结

参考文献

第三部分 丰富生存环境对神经-内分泌系统影响的生物信息学研究

1. 引言

2. 材料与方法

3 结果

4. 讨 论

5. 小结

参 考 文 献

总 结

1. 论文创新点：

2. 不足之处:

综 述:啮齿类动物丰富生存环境模型应用进展

致谢

已发表及待发表的论文