重组蛋白Ag85A-IL-17A构建及其抗哮喘小鼠气道炎症的实验研究生

摘要

研究背景:哮喘是一种以Th2型免疫反应亢进为特点的气道慢性炎症。IL-4、IL-13抗体在小鼠哮喘模型中发挥了一定程度的治疗或者预防作用。近来研究发现IL-17A在哮喘的发生、发展中起到重要作用，尤其是以中性粒细胞浸润为特点的重症哮喘。因此，我们推断IL-17A抗体可能对重症哮喘的治疗或者预防起到一定作用。机体对于自身抗原机体通过一系列的免疫耐受过程避免自身免疫反应，细胞因子自身不会在体内诱导自身抗体的生成。Boissier推测如果自身蛋白结合外源性蛋白，可以通过外源型蛋白的T细胞表位诱导B细胞反应，产生自身蛋白相关的中和抗体。Ag85A是卡介苗(BCG)中免疫原性较强的蛋白复合体Ag85中的三个主要的蛋白之一，能够刺激Th1型免疫反应，提高IFN-γ和IL-12含量。
　　目的:构建、表达重组蛋白Ag85A-IL-17A，研究其在哮喘小鼠气道炎症损伤中的作用。共分四步:(1)重组蛋白Ag85A-IL-17A的原核表达、纯化;(2)重组蛋白Ag85A-IL-17A的B细胞表位预测;(3)重组蛋白Ag85A-IL-17A的免疫原性和抗原性检测;(4)重组蛋白Ag85A-IL-17A在哮喘小鼠气道炎症损伤中的作用。
　　方法:(1)利用分子克隆的方法，将IL-17a的基因片段克隆至pET28a-Ag85a，获得pET28a-Ag85a-IL-17a的原核表达载体，将载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导获得重组蛋白Ag85A-IL-17A。SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定正确的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析及透析复性后即可获得纯化的Ag85A-IL-17A。(2)通过生物信息学的方法，使用Bcepred软件预测重组蛋白Ag85A-IL-17A的B细胞表位，并与IL-17A的B细胞表位做对比。(3)利用免疫学的方法，分析重组蛋白Ag85A-IL-17A的抗原性和免疫原性。实验小鼠分三组，PBS组、Ag85A组、Ag85A-IL-17A组，分别检测免疫蛋白后小鼠血清的IL-17A特异性抗体的滴度。(4)构建哮喘小鼠的动物模型，免疫重组蛋白Ag85A-IL-17A，研究其对哮喘小鼠气道炎症的作用。实验小鼠分四组，分别为PBS组、OVA组、OVB组以及Ag85A-IL-17A组。瑞吉氏染色观察各组BALF中炎症细胞数量及分类，ELISA测定BALF中Th2/Th17细胞因子含量，HE染色进行肺组织病理切片炎症评分，流式细胞术检测体外培养的脾细胞IL-13+T细胞含量以及RT-PCR检测肺组织趋化因子CXCL1、CCL2及转录因子RORγt的表达水平。
　　结果:克隆获得编码序列经测序鉴定与GenBank中的数据一致，成功构建了重组质粒pET28a-Ag85a-IL-17a，经SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定蛋白Ag85A-IL-17A在E.coli中成功表达。重组蛋白DNA序列包含1287个碱基，蛋白含429个氨基酸，蛋白的分子量在50kDA左右。重组蛋白Ag85A-IL-17A保留了IL-17A的3个的B细胞表位，分别是LGAKVSSRRPSDYLNRST176-193，TLHRNEDP197-204，和LVLKREP242-248。重组蛋白Ag85A-IL-17A具有抗原性，能够与IL-17A抗体结合，并且具有免疫原性，能够诱导小鼠体内产生较高浓度的IL-17A特异性抗体。OVB组哮喘小鼠模型BALF中IL-17A、IL-6明显高于普通哮喘小鼠模型，其炎症细胞分类中性粒细胞明显高于OVA组哮喘小鼠模型。重组蛋白Ag85A-IL-17A显著降低了BALF中Th17型细胞因子IL-17A、IL-6的含量以及Th2型细胞因子IL-13、IL-4的水平。重组蛋白Ag85A-IL-17A明显降低免疫小鼠小气道周围炎症以及BALF中总细胞数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞的数量。重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫小鼠的体外培养的脾细胞IL-13+T细胞的数量较OVB哮喘组明显降低，肺组织CXCL1和CCL2mRNA的水平也明显降低，而转录因子ROR-γt的表达水平没有明显改变。
　　结论:(1)成功构建、表达、纯化了重组蛋白Ag85A-IL-17A。(2)重组蛋白Ag85A-IL-17A的具有免疫原性和抗原性。(3)重组蛋白Ag85A-IL-17A在哮喘小鼠气道炎症模型中有一定的保护作用。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

参考文献

第一章 重组蛋白Ag85A-IL-17A构建、表达、纯化

1 材料

1．1 菌株、质粒、培养基

1．2 酶、抗体、化学试剂、抗生素及试剂盒

1．3 主要实验仪器

2 方法

2．1 原核表达质粒pET28a-Ag85a-IL-17a的构建

2．2 重组蛋白Ag85A-IL-17A原核表达、鉴定及纯化

3 结果

3．1 原核表达质粒pET28a-Ag85a-IL-17a鉴定

3．2 重组蛋白Ag85A-IL-17A原核表达、鉴定及纯化

4 讨论

参考文献

第二章 重组蛋白Ag85A-IL-17A生物信息学分析

1 材料

2 方法

2．1 分析蛋白mIL-I7A、Ag85A、Ag85A-IL-17A B细胞表位

2．2 蛋白Ag85A-IL-17A空间结构及B细胞表位展示

3 结果

3．1 重组蛋白mIL-17A、Ag85A、Ag85A-IL-17A B细胞表位

3．2 重组蛋白Ag85A-IL-17A空间结构及B细胞表位

4 讨论

参考文献

第三章 重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫原性、抗原性检测

1 材料

1．1 菌株、质粒、培养基

1．2 酶、抗体、化学试剂、抗生素及试剂盒

1．3 主要实验仪器

1．4 实验动物

2 方法

2．1 重组蛋白Ag85A、IL-17A原核表达、鉴定及纯化

2．2 双抗夹心法测重组蛋白Ag85A-IL-17A的抗原性

2．3 ELISA验证重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫原性

2．4 Western Blot验证重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫原性

3 结果

3．1 重组蛋白Ag85A、mIL-17A表达、鉴定及纯化

3．2 双抗夹心法测重组蛋白Ag85A-IL-17A的抗原性

3．3 ELISA测重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫原性

3．4 Western Blot验证重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫原性

4 讨论

参考文献

第四章 重组蛋白Ag85A-IL-17A对哮喘小鼠的气道炎症的抑制作用

1 材料

1．1 菌株、质粒、培养基

1．2 酶、抗体、化学试剂、抗生素及试剂盒

1．3 主要实验仪器

1．4 实验动物

2 方法

2．1 动物免疫及分组方法

2．2 标本采集与处理

2．3 指标检测

2．4 统计学分析

3 结果

3．1 重组蛋白Ag85A-IL-17A诱导小鼠血清IL-17A抗体产生

3．2 重组蛋白Ag856-IL-17A对哮喘小鼠气道炎症细胞影响

3．3 重组蛋白Ag85A-IL-17A对哮喘小鼠BALF细胞因子影响

3．4 重组蛋白Ag85A-IL-17A对哮喘小鼠脾细胞IL-13+T细胞影响

3．5 重组蛋白Ag85A-IL-17A对哮喘小鼠肺组织趋化因子影响

4 讨论

参考文献

第五章 全文总结

1 内容总结

2 特色及创新点

3 意义及展望

附录：实验室常规培养基及试剂配方

攻读博士期间发表学术论文及参加科学研究情况

致谢