斑马鱼C-cbl基因Ring Finger结构域突变导致的骨髓增殖性疾病及功能研究

摘要

作为造血干细胞的关键能力，自我更新和分化受到细胞内转录因子和信号网络的共同严密调控。任何自我更新和分化的调控异常都可能导致血液疾病发生。通过反向遗传学的方法我们已经知道了一些基因如pten、bmi1、hoxb4、 wnt等与造血干细胞的自我更新密切相关，但是已知的非常有限。因此我们在一个活体动物内进行全基因组饱和的、表型驱动的、无主观误差的正向遗传学筛选。
　　基于斑马鱼造血系统遗传学调控网络与人类有高度的相似性，我们设计应用ENU化学诱变技术，获得了近1，000个斑马鱼F2代隐性遗传突变家系，采用全胚胎原位杂交技术在F3代中进行筛选，确定影响定向造血干细胞发育、迁移和自我更新的突变家系，随后定位克隆这些关键基因并评估它们在人类造血干细胞疾病和白血病肿瘤干细胞恶性转化中的地位和作用。
　　目前已有的一些造血相关突变株，比如影响造血干细胞的早期发育的突变株spt(tbx16)、snh（bmp7）等，影响造血分化晚期各系的突变株如sau(a1s2)、ret(band3)，但是直接影响造血干细胞的突变株很少，如b1s等。
　　我们的筛选使用的是定向造血干细胞的标记runx1、c-myb来做原位杂交，因此筛到的很多突变都与造血干细胞有着密切的关系，本论文应用c-myb作为造血干细胞的标记进行了大规模三代遗传学筛选，发现了一个在斑马鱼肾脏和尾部造血组织(CHT)都有很明显且很特异表达升高的突变株LDD731。对这一突变株进行了造血表型的详细分析，得出以下几点结论:1）突变株LDD731定向造血干细胞有明显的增加，髓系、红系、单核巨噬系细胞也有明显的增加，而T淋巴细胞是正常的。定向造血干细胞的增加从3dpf(days post-fertilization)起已经可以通过原位杂交来区分，5dpf可以从光镜下区分，可看到尾部造血组织(CHT)处有非常明显的细胞数目增加。2）突变株LDD731原始造血不受影响，血管形态正常，其他如神经干细胞和生殖干细胞染色也是正常的，因此可以确定这个突变株是非常特异地影响了斑马鱼的定向造血。3）突变株LDD731纯合致死，通常9-14dpf死亡。杂合子可存活，杂合子无定向造血干细胞明显增加的表型。4）磷酸化组蛋白3(PH3)增殖检测实验发现突变株LDD731细胞增殖明显增加。全胚胎介导的dUTP缺口标记(TUNEL)实验表明细胞凋亡没有异常。对突变株进行5dpf外周血涂片瑞氏吉姆萨染色，与正常鱼外周血涂片染色相比，各阶段细胞均明显增加，包括个体较大、核质比很大的形态明显偏向于干、祖细胞的原始细胞。苏丹黑染色和O-dianisidine血红蛋白检测进一步证实粒细胞和红细胞成熟正常并有明显增殖的现象。以上这些都符合骨髓增殖性疾病(MPD)，也称为骨髓增殖性恶性肿瘤(MPN)。
　　随后我们对这一突变株进行了定位克隆，最终将突变基因定位在了斑马鱼15号染色体上的c-cb1基因，突变位点是第1144位碱基，从C突变为T，使第382位氨基酸从组氨酸突(H)变成了酪氨酸(Y)，突变位于这个基因非常保守的RING结构域。目前研究表明，c-cb1基因是一个负向调控自我更新和细胞周期的一个基因，是一个抑癌基因，并且它是一个E3泛素蛋白连接酶，RING结构域的主要功能是负向调控蛋白酪氨酸激酶受体。目前这一基因在人和鼠里的研究已很多，已有报道显示c-cb1基因突变后与骨髓增殖性疾病或者白血病密切相关。通过实验我们证实了LDD731的造血干细胞增殖表型的出现可能依赖FLT3信号通路，这与小鼠的实验结果相一致，人类中也发现了与LDD731突变株位点一样的突变，相应的突变是398位氨基酸，也是从组氨酸突变为酪氨酸，科学家们对几百例骨髓增殖性恶性肿瘤(MPN) c-cb1基因测序中发现有该一突变的，当然还不能确定地说这一位点的突变导致了MPN，但是LDD731突变株给予了直接的证据。
　　总体来说，我们的遗传学研究是很好的“基因组乒乓”的例子，将人和斑马鱼里的信息进行比较和对接，有助于我们更好地理解造血干细胞异常和白血病发生密切相关的基因及其机制。LDD731突变株是目前为止首个斑马鱼骨髓增殖性疾病的模型。参与骨髓增殖性疾病或白血病的信号通路很可能是非常复杂的，这突变株有助于我们理解信号通路的异常和致病机理的相关性，还可以用作药物筛选模型，为骨髓增殖性疾病和白血病提供靶向治疗研究的手段。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 造血干细胞及其自我更新

1．1．1 造血干细胞的发育与分化

1．1．2 造血干细胞自我更新及其调控机制

1．1．3 正向遗传学筛选突变株的意义

1．2 斑马鱼背景知识介绍

1．2．1 斑马鱼作为模式生物的历史

1．2．2 斑马鱼作为模式生物的独特优势

1．2．3 斑马鱼早期胚胎的发育

1．2．4 运用斑马鱼研究造血发育的生物学依据

1．2．5 斑马鱼在生命科学研究中的应用

第二章 利用正向遗传学方法筛选影响斑马鱼自我更新的突变株

2．1 前言

2．1．1 化学诱变剂ENU的简介

2．1．2 正向遗传学筛选的具体策略

2．2 材料和方法

2．2．1 实验用鱼及其喂养

2．2．2 ENU处理的过程

2．2．3 遗传家系的获得和突变家系筛选

2．2．4 突变家系的互补分析

2．2．5 全胚胎原位杂交探针制备

2．2．6 全胚胎原位杂交

2．2．7 试剂

2．3 结果

2．3．1 筛选结果总结

2．3．2 突变株的造血表型描述

2．4 讨论

第三章 突变家系的定位克隆

3．1 前言

3．1．1 定位克隆的原理

3．1．2 基因组“兵乓”

3．2 材料和方法

3．2．1 实验用鱼的准备

3．2．2 定位克隆的步骤

3．2．3 斑马鱼基因组DNA抽提及PCR

3．2．4 单胚胎RT-PCR及候选基因测序

3．2．5 生物信息学方法的使用

3．2．6 定位克隆所需引物

3．3 结果

3．3．1 突变株的突变基因是c-cbl

3．3．2 证实突变

3．3．3 对于突变基因的保守性分析

3．3．4 斑马鱼c-cbl基因的表达模式

3．4 讨论

第四章 斑马鱼c-cbl基因点突变导致的骨髓增殖性疾病

4．1 前言

4．1．1 c-cbl基因简介

4．1．2 c-cbl基因研究进展

4．2 材料与方法

4．2．1 全胚胎原位杂交

4．2．2 Morpholino knockdown及显微注射

4．2．3 质粒构建

4．2．4 体外转录制备c-cbl基因的polyA加帽mRNA及显微注射

4．2．5 磷酸化组蛋白3(pH3)免疫染色

4．2．6 全胚胎介导的dUTP缺口标记(TUNEL)检测凋亡细胞

4．2．7 外周血涂片瑞氏吉姆萨染色

4．2．8 苏丹黑Sudan black染色

4．2．9 血红蛋白O-dianisidine染色

4．2．10 抑制剂处理

4．2．11 斑马鱼胚胎的Western Blot检测

4．2．12 所需试剂及引物

4．3 结果

4．3．1 在功能上证实突变基因

4．3．2 突变株有明显的造血细胞增殖现象

4．3．3 Sudan Black染色表明成熟粒细胞有明显的增殖

4．3．4 O-dianisidine染色

4．3．5 突变所致的骨髓增殖性疾病可能依赖于flt3信号通路

4．4 讨论

参考文献

发表和待发表文章目录

致谢

综述 利用ENU诱导正向遗传学方法筛选斑马鱼造血干细胞自我更新和迁移的突变株的研究