雌激素受体β激动剂对肝硬化门静脉高压症大鼠肝内外血管床RhoA/ROCK和NO/PKG信号通路的影响

摘要

流行病学和实验研究发现和证实了雌激素具有对肝脏和血管系统的保护作用。但是雌激素替代疗法因其存在副作用限制其长期的应用。目前发现雌激素受体β介导的雌激素效应在肝脏和血管系统既有一定优势，又避免了其传统的副作用。
　　研究发现肝硬化PHT时，肝内上调的RhoA/ROCK信号通路和NO的合成利用不足，NO/PKG通路激活障碍提高了肝内血流阻力；而肝外循环系统ROCK的激活受限和 NO的产生过多导致了肝外血管的扩张和高动力循环状态。在本研究中，我们应用雌激素受体β激动剂DPN作用于CCl4诱导的肝硬化门静脉高压症模型，研究DPN对于肝内和肝外血管床中RhoA/ROCK和NO/PKG信号通路的激活情况，评价DPN对肝内血流阻力和肝外高动力循环以及肠系膜动脉血管反应性的作用，并且使用DPN干预体外培养的HSCs，观察细胞的收缩和 RhoA/ROCK信号通路激活。探讨DPN治疗肝硬化PHT的可行性及机制，为雌激素替代治疗肝硬化PHT提供理论依据和治疗策略。
　　第一部分：DPN对肝硬化PHT大鼠肝内血管床RhoA/ROCK和NO/PKG通路的影响
　　目的：流行病学和实验研究提示雌激素对肝脏门静脉系统具有保护作用，因此观察雌激素受体β激动剂DPN对（CCl4）诱导的肝硬化大鼠门静脉压力及肝内RhoA/ROCK和NO/PKG通路的作用，探讨DPN影响PHT的机制。
　　方法：使用DPN皮下注射去势雌性大鼠，并设立假手术组、去势肝硬化组和使用ERβ阻滞剂PHTPP组作为对照，HE染色和massion评价各组大鼠的肝硬化发生情况，免疫组化和免疫印迹法检测肝内α-SMA的表达。测定各组门静脉压力，并使用RT-PCR、免疫印迹法检测各组大鼠肝内RhoA/ROCK和NO/PKG信号通路中 mRNA和蛋白的表达和磷酸化情况，并通过免疫组化和免疫印迹法检测肝内p-MLC(Thr18/Ser19)的水平评价肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化情况。
　　结果：①CCl4诱导的各组大鼠均形成不同程度的肝硬化和PHT，其中DPN干预组无论是肝硬化程度还是门静脉压力都显著低于去势肝硬化组和PHTPP组，并且该组α-SMA的表达也较低，表明DPN抑制了HSCs的激活。②DPN不仅能降低该组大鼠RhoA、ROCK的mRNA和蛋白的表达，还能明显下调p-moesin（Thr558）的表达来抑制ROCK的激活。③DPN可以明显的提高eNOS的mRNA和蛋白的表达，提高p-eNOS的蛋白表达，抑制iNOS的蛋白表达提高肝内NO的合成与利用，并能通过上调p-VASP（Thr239）水平激活PKG。④DPN最终可通过下调p-MLC(Thr18/Ser19)的表达，抑制MLC的磷酸化水平，促进肝内血管平滑肌的舒张。
　　结论：①DPN能缓解CCl4大鼠的肝硬化程度，并能下调α-SMA，可能与DPN抑制HSCs的活化有关② DPN能通过抑制大鼠肝内RhoA/ROCK信号通路的表达和激活，缓解肝内血管床对缩血管物质的高反应性；DPN还能激活NO/PKG信号通路，提高NO的合成和利用，促使肝内血管扩张；最终可抑制MLC的磷酸化，缓解肝内血流阻力，降低门静脉压力。
　　第二部分：DPN通过抑制RhoA/ROCK信号通路的激活缓解肝星状细胞的收缩
　　目的：观察DPN对HSCs增殖、激活以及对ET-1介导的HSCs收缩的作用，并探讨DPN缓解ET-1介导的HSCs收缩的机制。
　　方法：以ROCK阻滞剂Y-27632为对照，利用MTT法检测各组药物对HSC增殖的影响。采用胶原凝胶法评价DPN缓解ET-1介导的HSCs收缩的作用，并使用免疫荧光和免疫印迹法检测各组大鼠α-SMA的表达，ROCK的激活情况和MLC的激活情况。
　　结果：① DPN和Y-27632均对HSCs的增殖具有抑制作用，并呈剂量依赖关系。并且DPN浓度从10-7mol/L至10-10mol/L对应Y-27632从10-5mol/L至10-8mol/L的抑制效果无显著统计学差别。②胶原凝胶收缩实验结果显示，10-7mol/L浓度的DPN对ET-1介导的HSCs的收缩具有明显的抑制作用，使用阻滞剂后其抑制作用消失，并且与10-5mol/L浓度的Y-27632的抑制效果相当。③DPN能抑制ET-1介导的HSCs中α-SMA的表达；并且对ET-1介导的HSCs中p-moesin（Thr558）的表达具有抑制作用，但是其抑制作用不如Y-27632；而DPN对于ET-1介导的HSCs中p-MLC(Thr18/Ser19)的表达的抑制作用与Y-27632无显著差别。
　　结论：DPN能呈剂量依赖关系抑制HSCs的增殖，并能抑制ET-1介导的HSCs的活化。胶原凝胶实验提示DPN能明显的抑制ET-1介导的HSCs的收缩，该作用与DPN能下调ROCK的激活，继而抑制MLC的磷酸化水平有关。虽然DPN抑制ROCK激活的效果不如Y-27632，但抑制MLC的磷酸化水平和细胞收缩的最终效果与 Y-27632已无显著差别，提示 DPN具有综合效应，其他机制也参与其中，需要进一步探讨。
　　第三部分：DPN对肝硬化PHT大鼠高动力循环及肠系膜动脉中RhoA/ROCK和NO/PKG信号通路的影响
　　目的：针对肝硬化PHT时肝外血管床受体脱敏引起的ROCK激活受限机制和NO产生过多、NO/PKG过度激活的机制，观察DPN对于去势肝硬化PHT大鼠高动力循环及肠系膜微动脉血管反应性的作用，并探讨其作用机制。
　　方法：使用DPN皮下注射去势雌性大鼠，并设立假手术组、去势肝硬化组和PHTPP组作为对照，放射性微球法测定各组大鼠高动力循环参数，并分离肠系膜微动脉，使用血管灌流系统测定其对去甲肾上腺素（NE）的反应性，免疫印迹法检测NE刺激后的各组大鼠肠系膜动脉（MA）中ROCK的激活情况，β-arrestin-2表达和ERK1/2的磷酸化水平；检测MAeNOS、p-eNOS、iNOS的表达和PKG的激活情况；并检测MLC的磷酸化水平。
　　结果：① DPN改善了去势肝硬化 PHT大鼠与高动力循环有关的血流动力学参数，但对平均动脉压和全身血管阻力没有影响②DPN干预组肠系膜微动脉对NE的反应性明显高于去势肝硬化组和PHTPP组，并且去势肝硬化组大鼠肠系膜微动脉经DPN孵育后，其反应性也提高。③DPN提高了NE刺激的MA中moesin的磷酸化水平，降低了β-arrestin-2表达和ERK1/2的磷酸化水平β-arrestin-2表达和ERK1/2的磷酸化水平。④DPN对去势肝硬化大鼠MA中eNOS、p-eNOS的表达没有影响，但能抑制 iNOS的表达，下调 p-VASP(Thr239)的激活⑤DPN能提高p-MLC（Thr18/Ser19）的表达，提高血管平滑肌的收缩性。
　　结论：DPN能明显改善去势肝硬化PHT大鼠高动力循环状态，提高肠系膜微动脉对 NE的收缩率和反应性。DPN是通过改善受体脱敏的机制提高去势肝硬化PHT大鼠MA中受抑制的ROCK的激活，并且通过减少iNOS来源NO的的机制抑制NO/PKG信号通路，最终上调MLC的磷酸化水平，提高VSM的收缩功能。

目录

声明

缩略词表

绪论

第一部分：DPN抑制RhoA/ROCK信号通路和激活NO/PKG信号通路缓解肝硬化PHT大鼠肝内血流阻力

材料与方法

结果

讨论

第二部分：DPN通过抑制RhoA/ROCK信号通路缓解肝星状细胞的收缩

材料与方法

结果

讨论

第三部分：DPN对肝硬化PHT大鼠高动力循环及肠系膜微动脉RhoA/ROCK和NO/PKG信号通路的影响

材料与方法

结果

讨论

全文结论

攻读博士期间发表的论文：

致谢

参考文献