Fenretinide对静止期急性髓系白血病细胞的特异性杀伤作用及机制研究

摘要

第一部分、fenretinide特异性杀伤静止期HL-60细胞及其机制研究
　　化疗耐药是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）临床治疗工作中亟需解决的问题。目前临床一线化疗药物都是细胞周期依赖性药物，大部分只对增殖期AML细胞有效，而对处于相对静止期的AML细胞效果很差，这是AML化疗失败的原因之一。因此，开发一种既是周期非依赖，又能通过其他途径诱导细胞凋亡的新型化疗药物对于克服耐药、改善AML治疗有着积极意义。Fenretinide（N-（4-hydroxyphenyl）retinamide,4-HPR）作为新型维甲酸衍生物，具有通过诱导活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的产生杀伤肿瘤细胞的作用。除了对多种肿瘤细胞发挥诱导凋亡作用外，fenretinide还同时具有靶向白血病干细胞和预防肿瘤发生/复发的作用，从而显示出其杀伤相对静止的肿瘤细胞的潜力。时至目前，有关fenretinide对同一肿瘤中不同周期状态细胞的毒性差异及其差异机制仍不清楚。
　　为了在同一肿瘤特征的细胞平台上探究fenretinide对增殖期和相对静止期AML细胞的毒性差异及相关机制，本研究通过血清饥饿法诱导HL-60细胞周期同步化，建立了周期相对静止的AML细胞模型。在此基础上，我们借助流式细胞术、集落形成实验检测fenretinide对周期状态不同的HL-60细胞活力、功能方面的影响并进行作用差异原因的探究，进而通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹法等探讨其杀伤相关细胞群体的机制。
　　本研究的结果显示：fenretinide对相对静止的HL-60细胞具有更强的诱导凋亡和集落形成抑制作用，并且在该细胞群体中诱导出了更高的ROS增幅。Fenretinide诱导相对静止HL-60细胞凋亡的过程伴随着胞内ROS的快速积累和NF-κB亚基与靶基因表达的下调。据此我们主要得出以下结论：1、fenretinide对慢增殖HL-60细胞的杀伤作用强于快增殖细胞，这可能与前者在药物作用下产生更多ROS有关。2、fenretinide通过诱导ROS和抑制NF-κB信号通路杀伤慢增殖HL-60细胞。这些结论提示：fenretinide作为一种周期非依赖性新型化合物，能够靶向相对静止的AML细胞发挥作用，在克服化疗耐药和复发方面具有较高的临床转化潜质。
　　第二部分、急性髓系白血病细胞分子遗传学特征与其对fenretinide反应性之间的关系研究
　　基于细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子遗传学的急性髓系白血病（ac ute myeloid leukemia,AML）精确分型是明确诊断、判断危险度、制定化疗方案的重要依据，同时也是以临床AML样本为对象的化疗药物研究的重要资料。传统的依据患者细胞核型进行危险度分层的方法具有一定局限性，即核型正常患者的预后也存在很大异质性。近年来，第二代DNA测序技术的发展使得FLT3、NPM1、CEBPA等众多与AML发生发展相关的基因突变被发现，其中一些已经成为预后判断的重要依据。各种基因突变的发生分别从不同角度参与了对AML发生发展的影响，可能涉及到不同化疗药物发挥作用的信号通路。因此，细化AML样本的分子遗传学特征有助于加深对疾病发生机制和生物学特征的认识，对AML化疗药物相关研究大有裨益。但是，在fenretinide杀伤原代AML细胞过程中，其对携带不同基因突变的样本是否具有作用效果的差异，现在仍不清楚。
　　为了明确携带不同基因突变的AML样本对fenretinide处理是否具有敏感性差异，本研究收集了32例原代AML样本，借助流式细胞实验检测了其在fenretinide作用下活力变化情况，同时通过PCR实验和测序、比对的方法对样本的FLT3-ITD/TKD、NPM1、NRAS、IDH1、CEBPA等基因突变情况进行检测，最后对两部分信息进行汇总分析。
　　本研究的结果显示：原代AML CD34+CD38-细胞在fenretinide处理下显示出程度不一的活力下降现象。携带FLT3突变的样本的活力下降幅度显著大于FLT3野生型样本，这种差异未在其他基因突变类型中观察到。据此我们主要得出以下结论：1、fenretinide对AML干细胞具有显著的诱导凋亡作用。2、fenretinide对于FLT3-ITD/TKD突变阳性的AML干细胞显示出比野生型细胞更强的杀伤作用。这些结论拓展了对fenretinide杀伤肿瘤细胞潜力的现有认识，提出了该药物在改进AML化疗方案、改善携带FLT3突变AML患者预后中的潜在应用价值。

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目录

第一部分 fenretinide特异性杀伤静止期HL-60细胞及其机制研究

摘要

ABSTRACT

引言

实验材料和仪器

一、细胞培养

二、实验试剂

三、实验仪器

四、引物序列

实验方法

一、血清饥饿法诱导HL-60细胞周期同步化

二、流式细胞术相关实验

三、细胞增殖实验

四、集落形成实验

五、实时定量RT-PCR实验

六、蛋白印迹实验

实验结果

一、血清饥饿法建立周期相对静止的HL-60细胞模型

二、fe nre tinide对慢增殖HL-60细胞具有选择性诱导凋亡作用

三、fe nre tinide选择性降低慢增殖HL-60细胞的集落形成能力

四、fenretinide在慢增殖HL-60细胞中诱导出更高的ROS增幅

五、fe nre tinide比一线化疗药物Ara-C更倾向于杀伤慢增殖HL-60细胞

六、ROS上升和NF-κB抑制参与了fenretinide诱导的慢增殖HL-60细胞凋亡

讨论

一、Fenretinide能够选择性抑制静止期AML细胞的活力和功能

二、Fenretinide杀伤静止期AML细胞的分子机制

三、Fenretinide和常规药物联用对于改善AML化疗方案的潜力

四、血清饥饿HL-60细胞模型建立的意义

第二部分 急性髓系白血病细胞分子遗传学特征与其对fenretinide反应性之间的关系研究

摘要

ABSTRACT

引言

实验材料和仪器

一、细胞采集

二、实验试剂

三、实验仪器

四、引物序列

实验方法

一、原代AM L细胞的获取与处理

二、AM L样本的分子遗传学特征检测

三、AML样本对fenretinide敏感性检测

实验结果

一、对32例原代AM L样本进行预后相关基因的突变检测

二、12例AML原代样本对fenretinide敏感性检测

三、AML样本对fenretinide敏感性与其分子遗传学特征关系探究

讨论

参考文献

硕士就读期间发表论文

致谢