细菌分解代谢氮杂环污染物尼古丁的分子机制研究

摘要

尼古丁是N-杂环污染物的典型代表，1994年就被列入了美国环保局的有毒物质释放清单，致瘾性和毒性很强，容易诱发多种疾病。尼古丁污染主要来自于烟草工业中产生的富含尼古丁的烟草废弃物和人们随意丢弃的富含尼古丁的烟蒂垃圾。我国的烟草生产量和消费量世界最大，每年产生的尼古丁污染物以百万吨计，极大地威胁着自然环境和人类健康。因此，消除尼古丁的污染迫在眉睫。
　　微生物修复以其快速、高效、无二次污染的特点而受到大家的广泛关注。目前已报道的尼古丁代谢微生物主要集中在节杆菌属（Arthrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）细菌中。除尼古丁降解能力外，这些细菌还具有很强的环境适应能力，揭示它们的尼古丁代谢途径和分子机制，探索其中关键酶的酶学和结构特性，阐释它们环境存活能力的基因基础，能够指导对这些细菌的定向改造，具有极大的理论研究价值和应用前景。
　　根据其他推测或已报道的2,5-二羟基吡啶(2,5-DHP)代谢途径，本研究首次提出并验证了假单胞菌中尼古丁吡咯烷下游代谢途径如下：尼古丁降解生成的2,5-DHP开环裂解生成N-甲酰基马来酰胺酸（NFM），然后NFM去甲酰生成马来酰胺酸和甲酸，马来酰胺酸进一步脱氨生成马来酸，接着马来酸异构化生成富马酸，然后进入三羧酸循环中为菌体提供能量。
　　本研究通过简并引物扩增和基因组序列分析等方法在尼古丁降解菌Pseudomonas putida S16中分离到了一个参与尼古丁吡咯烷下游代谢途径的基因簇nic2（GenBank登录号为GQ857548），其中含有6个转录方向一致的开放阅读框（ORF），依次为6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶基因（hspB），未知功能基因（orfx），马来酸异构酶基因（iso），NFM去甲酰酶基因（nfo），2,5-DHP双加氧酶基因（hpo）和马来酰胺酸酰胺酶基因（ami）。比较基因组和进化树分析说明nic2基因簇可能是S16通过基因水平转移获得的，而且其来源与其他假单胞菌里的相应基因簇不同。
　　前期的研究发现P.putida S16中还存在一个HspB的同工酶—HspA，本研究发现敲除hspA的S16能够以尼古丁为唯一碳氮源生长且其尼古丁降解能力与野生型S16相差无几，而敲除hspB的S16则不能在尼古丁培养基中生长并且其休止细胞只能将尼古丁转化为HSP，而不能进一步降解HSP。另外，本研究还发现敲除hpo的S16虽然能在尼古丁培养基中生长但是其生长速度明显慢于野生型S16，并且其菌液呈现深褐色而不是正常的淡绿色。休止细胞实验发现该菌能将尼古丁转化为2,5-DHP，但是不能进一步对其进行降解。上述结果都说明nic2基因簇对于P.putida S16的尼古丁降解能力至关重要。
　　为了验证hpo, nfo和ami基因表达产物的功能，将其分别克隆至表达载体pET28a中，表达并纯化C端带有6个组氨酸标签的His-Hpo，His-Nfo和His-Ami。UV检测证明His-Hpo能催化2,5-DHP的降解且活性依赖于Fe2+。其对2,5-DHP的Km值为0.168 mM，Vmax值为16.6 U mg-1，kcat值为10.8 s-1。利用His-Nfo和甲酸脱氢酶双酶偶联法检测反应体系中甲酸的生成，证实了His-Nfo能够催化NFM的去甲酰化。采用His-Ami和谷氨酸脱氢酶双酶偶联法检测反应体系中NH4+的产生，证明了His-Ami能够催化马来酰胺酸的脱氨。
　　Hpo是NicX所属新双加氧酶家族的第二个成员。本研究在纯化了这两个双加氧酶的基础上，对其催化机制和酶学性质进行了研究比较，揭示了这个新双加氧酶家族成员之间的酶学共性和特性。发现它们特异性地催化2,5-DHP的开环双加氧，催化1 mol2,5-DHP消耗1 mol的O2，将O2中的两个O原子都加到了2,5-DHP上，它们的活性都依赖于Fe2+，与Fe2+的结合比例均为1:1，在活性状态下，Hpo以三聚体的形式存在而NicX是由两个三聚体组成的六聚体。酶动力学参数比较发现His-Hpo对底物2,5-DHP的亲和能力要低于His-NicX，而催化效率则是其3.7倍。通过结构预测和定点突变，本研究确定了Hpo中由257位和310位的两个组氨酸及312位的天冬氨酸组成的2-组氨酸-1-羧酸Fe2+结合结构域HX52HXD，该结构域在Hpo和NicX中高度保守但是与其他非血红素 Fe2+依赖型酶的类似结构域在氨基酸排列方式或羧酸供体上有所不同。
　　这40多年来，究竟是什么蛋白催化了NFM水解一直存在着争议。Gauthier和Rittenberg提出NFM的水解也是由2,5-DHP双加氧酶所催化的，该酶同时具有双加氧酶和去甲酰酶的活性。但是Behrman认为NFM及其反式异构体N-甲酰基富马酰胺酸（NFF）的水解是自发的，不需要酶的参与。Jiménez等人则认为2,5-DHP双加氧酶只能催化2,5-DHP裂解生成NFM，NFM的水解则是由另一个去甲酰酶所催化的。本研究在获得了化合物NFM和NFF的基础上，通过ESI-TOF-MS检测手段，发现所纯化的两个2,5-DHP双加氧酶均不能进一步催化NFM或NFF的水解，NFM和NFF确实会发生一定程度的自发水解，但是His-Nfo极大地促进了其水解过程，而且His-Nfo对NFM的催化效率是对NFF的约1400倍。这些研究结果一举解决了上述争议。
　　节杆菌是两种最主要的尼古丁降解微生物之一，但是对该属菌株的尼古丁降解研究还只停留在质粒水平（质粒pAO1）。本研究以尼古丁降解菌A.aurescens M2012083为研究对象，首次解析了尼古丁降解节杆菌的全基因组信息，发现了大质粒pAO1中缺失的尼古丁代谢所必须的基因moeB和mogA。通过同线性分析，在M2012083的基因组中发现了一个68,622 bp的DNA片段，与质粒pAO1中的尼古丁代谢相关序列有98.1％的序列相似性，质粒pAO1中所有与尼古丁代谢相关的基因在该片段中都有同源基因的存在。但是，质粒pAO1中的整合酶基因xerD和包含解离酶基因的插入序列IS1473在该片段中并不存在，转座酶基因编码序列Tn554在该片段中也不完整。另外，除上述尼古丁代谢相关序列外，质粒pAO1的其他序列与M2012083基因组没有明显的相似性，其中大多数行使质粒本身功能的基因在M2012083基因组中均未找到同源基因。说明A.aurescens M2012083的尼古丁代谢相关基因存在于不同于质粒pAO1的质粒上或者染色体上，并且可能是质粒pAO1中尼古丁代谢相关基因的水平转移供体。
　　本研究详细比较了M2012083与其他6株已完成基因组全图的节杆菌，发现了大量参与这些菌特有功能和生存环境适应能力的基因。在此基础上，本研究发现了17个可能参与菌株M2012083压力应答的σ70转录因子和109个与菌株M2012083环境变化适应能力相关的基因，其中包括8个全局的压力应答蛋白，35个渗透压力应答蛋白，29个氧化压力消除蛋白，21个冷热激应答蛋白，4个脱毒蛋白以及12个其他压力应答蛋白，并阐释了这些蛋白可能行使的功能。
　　综上，本研究着眼于最主要的两种尼古丁代谢微生物——假单胞菌属和节杆菌属尼古丁代谢细菌，分别以P. putida S16和A. aurescens M2012083为研究对象，揭示了P.putida S16中尼古丁吡咯烷下游代谢途径的分子机制和 A.aurescens M2012083的尼古丁代谢能力及环境适应能力的基因基础。这些研究成果填补了细菌尼古丁代谢分子机制研究领域的一部分空白，为定向改造尼古丁代谢假单胞菌和节杆菌提供了重要的理论依据，对最终实现将其快速、高效、持久地应用于尼古丁污染环境的生物修复意义重大。

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第一章 前 言

1.1 氮杂环污染物概述

1.2 尼古丁及其环境污染

1.3 微生物尼古丁代谢机制研究进展

1.4 尼古丁代谢细菌的基因组学研究

1.5 本课题的研究意义

第二章 假单胞菌S16尼古丁下游代谢关键基因/簇分离鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 2,5-二羟基吡啶双加氧酶（Hpo和NicX）的性质研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 NFM去甲酰酶和马来酰胺酸酰胺酶的性质研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 尼古丁代谢节杆菌M2012083比较基因组分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

结论与展望

本论文的主要研究内容总结如下：

本论文的不足之处以及对本研究课题的展望：

创 新 点

参考文献

附录I 仪器设备

附录II 主要试剂

附录III 缓冲液

附录IV 菌株及质粒

附录V 引物信息

附录VI 标准曲线

附录VII 七株节杆菌中的压力应答蛋白

致谢

攻读博士期间（待）发表论文及所获奖励