转基因动物乳汁中高效、稳定表达人FVⅢ的研究

摘要

人凝血因子VIII（hFVIII）是一种重要的凝血蛋白，它的缺失或缺乏会导致血友病A。目前血友病A的治疗方法主要是注射给病人重组凝血因子VIII蛋白或来源于血浆的VIII因子浓缩产品。但目前这些方法存在病毒污染、产量低、价格昂贵等风险，近年来动物乳腺生物反应器以其产量高、成本低、生物活性高的优势成为一种新型的生物制药模式，本工作目的为研制用于动物乳腺生物反应器生产 hFVIII的高效表达载体，并在细胞和小鼠水平上分别进行其体外、体内表达系统的研究。
　　在本文的第一部分，我们分别构建了由巨细胞病毒（CMV）、山羊β-酪蛋白调控序列（P1A3)和小鼠血清白蛋白调控序列（Pa lb）为启动子驱动的表达全长hFVIII和B区缺失（删除了编码760aa-1639aa的核苷酸序列）hFVIIIBDD cDNA的六种真核载体。转染细胞实验结果显示，六种载体在转录水平均有hF VIII的表达。将所构建的载体瞬时注射哺乳期的小鼠乳腺，ELISA检测结果显示，CMV-hFVIII和P1A3-hFVIII质粒转染后的小鼠乳汁中hFVIII的最高含量分别为2.01±0.23和1.20±0.21μg/mL，Palb-hFVIII和Palb-hFVIIIBDD转染后在小鼠乳汁中检测不到表达。CMV-hFVIIIBDD和P1A3-hFVIIIBDD质粒的表达情况与全长hFVIII相符，且瞬时转染小鼠乳腺后在乳汁中的最高表达量分别为2.81±0.31和1.82±0.25μg/mL，均高于同种启动子之全长hFVIII的表达量。
　　本文第二部分的研究内容为，分别将CMV、P1A3和Palb启动子连接的hFVIII及hFVIIIBDD片段构建的六种载体，分别通过显微注射制备转基因小鼠，应用RT-PCR、real time PCR、ELISA、IHC和Western blot等方法检测各载体在小鼠各脏器中的hFVIII的表达及分布。结果显示，CMV-hFVIII（hFVIIIBDD）在转基因小鼠的各个脏器中均有hFVIII表达，而Palb-hFVIII（hFVIIIBDD）和P1A3-hFVIII（hFVIIIBDD）分别在肝脏和乳腺中特异表达hFVIII。且P1A3-hFVIII和P1A3-hFVIIIBDD转基因小鼠乳汁中hFVIII平均浓度分别为1.16±0.80μg/mL和2.45±0.80μg/mL，其相应的平均活性分别为337±118 mU/mL和662±114mU/mL。各种转基因小鼠与野生型小鼠相比，没有不良的生理异常如呼吸困难，不育或哺乳障碍等。由于P1A3启动子的hFVIIIBDD载体具有乳腺组织特异表达的特点，且能高效表达有活性的重组hFVIII，因此更适用于乳腺生物反应器的研制。
　　在本文的第三部分，重点开展了利用血管性血友病因子（vWF)在hFVIII转基因小鼠的乳汁中共表达来提高hFVIII稳定性的研究。我们构建了vWF与hFVIII的共表达载体P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF，并制备其相应的共表达转基因小鼠，在不同储存条件和不同时间点分别检测转基因小鼠乳汁中的hF VIII发现，其hFVIII活性在体外降解到一半的时间（Td1/2v）分别是77.21h（4oC）,32.45h（室温）和7.40h（37oC）；明显的高于P1A3-hFVIIIBDD小鼠的时间43.82h（4oC），19.67h（常温）和3.44h（37oC），相同条件下的两组数值之间有统计学差异（P<0.05）。同时我们也利用CMV-vWF载体生产转基因小鼠，获得的CMV-vWF转基因小鼠与P1A3-hFVIIIBDD转基因小鼠杂交获得P1A3-hFVIIIBDD/CMV-vWF双重杂合子小鼠。检测双重杂合子转基因小鼠乳汁中hFVIII的活性，结果显示不同条件下hFVIII活性的Td1/2v值与P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表达转基因小鼠的时间相似，两者间数值无统计学差异。综上结果显示，在转基因小鼠乳汁中vWF的共表达能对凝血因子VIII起到明显的稳定作用。鉴于双重杂合子的制备耗时耗力，且传代过程中性状会发生分离等特点，P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表达载体更适用于转基因动物乳腺生物反应器的研制。
　　本研究结果表明，（1）P1A3启动子能启动hFVIII在小鼠乳腺组织特异表达；（2）P1A3引导的hFVIII（hFVIIIBDD）基因在转基因小鼠乳汁中能表达有凝血活性的hFVIII，且B区缺失的hFVIIIBDD载体在转基因小鼠乳汁中的hFVIII蛋白表达量高于全长的hFVIII载体；（3）在hFVIII转基因小鼠乳汁中共表达的vWF可以明显增加hF VII I的稳定性。

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缩 写 词

绪论

绪论参考文献

第一章 不同启动子对人凝血因子VIII基因在细胞和小鼠乳腺中表达的影响

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

参考文献

第二章 人凝血因子VIII转基因小鼠的制备、鉴定及hF VIII表达分析

2.1 材料

2.2方法

2.3 结果

2.4讨论

参考文献

第三章 在转基因小鼠乳汁中vWF和hF VIII的共表达对hF V III稳定性的影响

3.1材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4讨论

参考文献

结论

文献综述:人凝血因子VIII稳定性的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的文章