灰色链霉菌JSD-1发酵工艺及代谢产物研究

摘要

利用微生物降解秸秆可有效解决秸秆资源浪费和环境污染等问题，但目前对具有秸秆降解能力的微生物的研究主要集中在细菌和真菌上，对放线菌的研究特别是产酶能力和秸秆降解速度等方面研究较少。本研究以一株具有高效降解秸秆能力的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）JSD-1为研究对象，采用响应面优化方法分别对其生长培养基、产酶培养基及发酵培养条件进行了优化，并利用 GC/TOF-MS对该菌株降解秸秆的代谢产物进行了研究分析。主要研究结果如下：
　　筛选出JSD-1生长的最佳培养基为小米培养基，并对其成分及浓度进行优化。采用Plackett-Burman试验设计方法筛选获得了显著影响因子，进一步利用 Box-Benhnken响应面设计对上述影响因子进行优化，通过方差分析和模型预测结果显示当小米粉为13.35g/L，碳酸钙为6.26 g/L，蛋白胨为4 g/L，甘油20 g/L，蛋白胨3 g/L时，JSD-1的生物量达到最大值10.36 g/L，较优化前提高了59％。
　　研究不同添加剂对JSD-1产纤维素酶的影响。结果显示，添加2%的麸皮对JSD-1产羧甲基纤维素酶（CMCase）有较大提高幅度，添加1.5% Tween20时 JSD-1产 CMCase显著提高，外切葡聚糖酶活（CBHase）、滤纸酶活（FPase）及总蛋白量也高于其他处理条件。通过研究细胞膜磷脂的变化，解释这两种表面活性剂的促酶活效应机理。最后采用响应面试验优化Tween20添加浓度、培养温度、pH的协同效应。结果显示当添加Tween20浓度为1.47%，发酵温度为32℃，控制发酵pH7.51时得到纤维素酶活最高值65.482 U/mL。
　　研究菌株在5L罐上发酵过程的参数变化，确定了pH值对纤维素酶活的产能有较大影响，提出了一种两阶段的pH值控制策略，即在JSD-1菌株发酵前48小时控制pH值8.0，保持菌体生物量高产出，48 h后将pH值控制在7.5保持CMCase和FPase高产率，最后通过水稻秸秆降解试验证明了该策略的有效性。
　　采用GC/TOF-MS仪器对JSD-1菌株生长的代谢机制以及降解秸秆的胞外代谢产物进行测定分析，结果显示JSD-1菌株降解秸秆的产物主要为有机酸，JSD-1生长代谢中转化氨基酸的能力最强，通过氨基酸代谢转化TCA循环的中间物质参与到菌体TCA循环中。

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第一章 文献综述

1.1秸秆降解的研究现状

1.2纤维素及纤维素酶

1.3高产纤维素酶的微生物资源

1.4影响纤维素酶产量的因素

1.5统计方法在纤维素酶活优化中的应用

1.6本文的研究目的、意义及技术路线

第二章 统计学方法优化JSD-1生长培养基和纤维素酶活方法

2.1引言

2.2实验材料与方法

2.3试验设计

2.4结果与分析

2.5小结与讨论

第三章 添加剂和pH值对JSD-1产纤维素酶的影响

3.1引言

3.2实验材料与方法

3.3结果与分析

3.4小结与讨论

第四章 JSD-1降解水稻秸秆纤维素的代谢分析

4.1引言

4.2实验材料与方法

4.3结果与分析

4.4小结与讨论

第五章 结论与展望

5.1实验总结

5.2创新点

5.3展望

参考文献

致谢

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