雄激素受体及共调节因子在雄激素调控勃起信号通路VIP/cAMP中的作用

摘要

目的:
　　1.探讨雄激素对阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavemosum smooth muscle cells，CCSMCs)自噬和凋亡的影响，重点研究其对自噬和凋亡桥梁分子BECN1∶Bcl-2的调节作用。
　　2.探讨雄激素浓度和雄激素受体(androgen receptor, AR)活性变化对血管活性肠多肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）调控勃起作用的影响。
　　3.探讨雄激素浓度变化对AR及共调节因子表达的影响，AR及共调节因子信号通路与VIP/cAMP/PKA信号通路的相互作用，进而明确低雄激素浓度时勃起功能维持的机制。
　　方法:
　　1.雄性SD大鼠随机分为6组:正常对照组（A组）、手术去势组（B组）、去势后补充十一酸睾酮组（C组）、单独给予AR拮抗剂氟他胺组（D组）、去势后给予氟他胺组（E组）、去势后给予十一酸睾酮和氟他胺组（F组）。
　　2.结合体内电刺激海绵体神经测定海绵体内压力和离体平滑肌条实验测定海绵体平滑肌的舒缩功能，来评估各组大鼠勃起功能情况。
　　3.通过HE染色、Masson三染色、透射电镜观察各组大鼠阴茎结构的变化。
　　4.采用ELISA方法测定各组大鼠血清睾酮浓度的变化。
　　5.通过透射电镜观察CCSMCs自噬情况，TUNEL染色观察CCSMCs凋亡情况。
　　6.通过免疫组化和Western Blot对勃起相关指标(eNOS、nNOS)、阴茎结构相关指标(α-SMA、TGF-β1)、自噬相关指标(LC3、BECN1)、凋亡相关指标(Bcl-2、Bax)、VIP信号通路关键分子(VPAC2、PDE3A、Gαs、Gαi)、AR及共调节因子（CBP、p300、SRC-1、NCoR1、NCoR2）等进行定位和定量分析。
　　7.结合大鼠阴茎内注射VIP和离体平滑肌条实验探讨雄激素浓度和AR活性变化对VIP调控勃起作用的影响。
　　8.组织块法进行大鼠CCSMCs原代培养，MTT法检测不同雄激素浓度对CCSMCs生长的影响;结合体内外研究雄激素浓度变化对AR及共调节因子表达的影响。
　　结果:
　　1.与A组相比，B和E组大鼠阴茎和前列腺明显萎缩，阴茎海绵体平滑肌成分减少、纤维化程度增加，α-SMA表达减少、TGF-β1表达增加;血清睾酮浓度明显降低;电刺激ICP/MAP明显下降，离体平滑肌条舒缩功能均减弱，勃起相关指标eNOS和nNOS表达减少;除D组血清睾酮浓度增加外，其他指标及其他组的各个指标均介于A组和B组之间。
　　2.与A组大鼠相比，B组大鼠CCSMCs的自噬体数量明显减少，自噬指标BECN1和LC3-Ⅱ蛋白表达降低;凋亡指数较高，抗凋亡指标Bcl-2表达降低，促凋亡指标Bax表达增加。
　　3.各组大鼠海绵体注射VIP后勃起功能均增高，且组间差异无统计学意义，但注射VIP后与注射前勃起功能的比值有差别，由高到低依次为:E组＞B组＞D组＞C组＞A组＞去F组;各组大鼠海绵体平滑肌条VIP的最大舒张反应差异无统计学意义;去势大鼠海绵体VPAC2和Gαs表达增加，PDE3A和Gαi-2表达降低。
　　4.睾酮对CCSMCs生长的影响与其剂量有关系，双氢睾酮10-5 mol/L时刺激CCSMCs生长最明显，浓度过低(＜10-9 mol/L)或过高(＞10-4 mol/L)时刺激细胞生长的作用都会减弱。
　　5.体内研究:不同雄激素浓度的各组（A、B、C组）大鼠海绵体AR的表达差异无统计学意义;与正常大鼠相比，去势组大鼠AR共激活因子CBP、p300、SRC-1表达均增高。体外研究:相比生理剂量雄激素组，低剂量雄激素组CCSMCs内AR表达降低，高剂量雄激素组AR表达增高;低剂量雄激素组CCSMCs内AR共激活因子CBP、p300、SRC-1表达均增高。
　　结论:
　　1.去势通过抑制CCSMCs自噬和促进凋亡而损害阴茎正常的勃起结构和功能，其中可能主要是通过自噬和凋亡关键分子—BECN1∶Bcl-2的调控作用。
　　2.VIP发挥作用可能并不依赖雄激素浓度或AR活性，属于雄激素非依赖性的勃起神经递质。VIP/AC/cAMP信号通路可能在正常雄激素浓度时起辅助作用、而在低雄激素浓度时起重要作用。
　　3.雄激素对AR及其共调节因子有复杂的调控作用，AR及共调节因子信号通路与VIP/cAMP/PKA信号通路之间存在交叉激活机制。低雄激素时，CCSMCs内AR表达不变或降低，而AR共激活因子(CBP、p300、SRC-1)表达增高。在AR共激活因子的协同作用下，AR及共调节因子信号通路通过交叉激活而增强VIP/cAMP/PKA信号通路的作用，从而使得低雄激素浓度时勃起功能得以维持。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

绪论

第一部分 不同雄激素浓度和AR活性大鼠模型的建立

1 前言

2 目的

3 实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂

3．3 实验仪器及器材

4 实验方法

4．1 大鼠分组和处理

4．2 大鼠勃起功能测定

4．3 大鼠血清睾酮水平ELISA检测

4．4 阴茎和前列腺组织学检查

4．5 免疫组织化学染色

4．6 Western Blot检测

4．7 统计方法和作图方法

5 结果

5．1 各组大鼠体重、大体标本、血清睾酮浓度

5．2 各组大鼠的基础勃起功能结果

5．3 阴茎光镜检查结果

5．4 前列腺光镜检查结果

5．5 eNOS和nNOS的免疫组化和Western Blot结果

6 讨论

7 结论

第二部分 自噬和凋亡在去势性勃起功能障碍发生中的作用

1 前言

2 目的

3 实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂

3．3 实验仪器及器材

4 实验方法

4．1 免疫组织化学染色

4．2 Western Blot检测

4．3 TUNEL染色检测凋亡

4．4 透射电镜检测自噬情况

4．5 统计方法和作图方法

5 结果

5．1 去势对阴茎结构的影响

5．2 去势对海绵体平滑肌细胞自噬的影响

5．3 去势对海绵体平滑肌细胞凋亡的影响

6 讨论

7 结论

第三部分 雄激素浓度和从活性变化对VIP调控勃起作用的影响

1 前言

2 目的

3 实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂

3．3 实验仪器及器材

4 实验方法

4．1 体内研究：VIP调控大鼠勃起的剂量确定

4．2 体内研究：雄激素浓度和AR活性变化对VIP调控勃起作用的影响

4．3 离体研究：各组大鼠海绵体平滑肌基础收缩和舒张功能检测

4．4 离体研究：雄激素浓度和AR活性变化对VIP舒张阴茎海绵体平滑肌的影响

4．5 免疫组织化染色

4．6 Western Blot检测

4．7 统计方法和作图方法

5 结果

5．1 VIP调控大鼠勃起的剂量确定结果

5．2 雄激素浓度和AIR活性变化对VIP调控勃起作用的实验结果

5．3 各组大鼠海绵体平滑肌基础收缩和舒张功能结果

5．4 雄激素浓度和AR活性变化对VIP舒张阴茎海绵体平滑肌的影响结果

5．5 免疫组化和Western Blot结果

6 讨论

7 结论

第四部分 雄激素浓度变化对AR及共调节因子表达的影响

1 前言

2 目的

3 实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂

3．2 实验仪器及器材

4 实验方法

4．1 免疫组织化学染色

4．2 Western Blot检测

4．3 海绵体平滑肌细胞培养及鉴定

4．4 MTT法检测不同雄激素浓度对海绵体平滑肌细胞的影响

4．5 体外研究雄激素浓度变化对AR及共调节因子表达的影响

4．5 统计方法和作图方法

5 结果

5．1 体内研究雄激素浓度变化对AR及共调节因子表达的影响

5．2 海绵体平滑肌细胞培养及免疫细胞染色鉴定结果

5．3 MTT法检测不同雄激素浓度对海绵体平滑肌细胞的影响结果

5．4 体外研究雄激素浓度变化对AR及共调节因子表达的影响

6 讨论

7 结论

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的获奖情况和学术活动

攻读学位期间发表的学术论文

攻读学位期间的学生工作和社会活动