Nitrogen dynamics and microbial diversity in soils under organic vegetable production

摘要

氮素（N）是地球上最多的元素之一，但是在很多农业生产系统中常以植物不可利用的形态存在，因此N成为限制植物生长的主要因素。低投入系统中，常因为有机物料矿化缓慢，造成N缺乏，进而影响作物生长。因此有机系统产量相比常规系统较低。考虑到在低投入系统中N素在农业生产中的关键作用，研究N动态变化过程对指导生产实践显得尤为重要。很多研究认为植物可以吸收和同化有机氮，有机氮具有作为重要N源的潜能。近年来，许多研究针对森林生态系统土壤有机氮库进行了定量分析，而针对农田系统氮库的研究鲜有报道。微生物群落的结构和变化过程在生物地球化学之间养分的循环中起关键作用，如受细菌和真菌介导的有机质降解和营养循环过程。大气固氮作用同样需要借助原核生物产生的固氮酶来发挥作用，它是许多生态系统的重要过程，同时也是低投入系统N素的重要来源。本课题组前期已对菜田土壤进行了一定程度的研究并在菜田土壤有机氮库的组成和分布方面取得了一定的成果，因此，进一步研究栽培模式和土壤理化性质如何影响土壤中参与 N转化的微生物群落结构及其分布和丰度可更好地理解农业系统中氮的生物地球化学循环并为土壤可持续利用服务。
　　本文以上海地区蔬菜生产系统为研究对象，采用固氮微生物群落的标记基因nifH，研究一年内不同生产方式（有机、常规）和不同栽培方式（温室和露地）园艺系统的固氮菌群落DNA的条带和RNA的活性差异。用PCR-变性梯度凝胶电泳（DGGE）研究固氮菌群落结构变化。用实时定量PCR（qPCR）测定nifH-harboring bacteria的丰度。将突出的DGGE条带切下后测序用以研究固氮菌的种系组成。土壤样品于2010年7月、11月、2011年2月和5月分别采自上海崇本堂有机生态农场和叶榭蔬菜园艺场。上海崇本堂有机生态农场，已有6年有机蔬菜栽培历史；叶榭蔬菜园艺场有10年蔬菜常规种植历史。两种生产系统均包括露地和设施大棚两种栽培模式，大棚和露地相邻，土壤环境一致。在上述两个地区4个处理（有机大棚、有机露地、常规大棚、常规露地）各选择3个典型地块作为三个重复，每地块面积45 m×50 m。所选小区均具有相同的作物和茬次及其他农田管理措施。每个小区按S形用取土器取0-20 cm土层土壤样品8个点并混合作为一个重复。取样后去除可见植物残渣、石子等杂物，立刻存于自封袋内，放于事先准备好的冰盒中带回实验室。
　　用相同的土壤样品，以土壤微生物 DNA和RNA的18S rRNA为目的片段，用PCR-DGGE技术研究了土壤真菌群落多样性。本研究进一步测定了与土壤微生物相关的土壤的特性（如：总碳、电导率、无机氮库、有机氮库和pH），确定影响真菌群落的土壤理化因子。
　　另外，我们向有机和常规土壤中分别添加相同N量的：尿素，苜蓿、稻秆和堆肥，用以研究有机管理和肥料对氨基酸组分和含量的影响。试验土壤于2013年3月，在上海崇本堂农场有机和常规生产系统露地种植区获取，采样方法同上。试验共设8个处理：常规土壤，常规土壤+尿素，常规土壤+苜蓿，有机土壤，有机土壤+有机肥，有机土壤+尿素，有机土壤+秸秆，有机土壤+苜蓿。将尿素、苜蓿、有机肥、秸秆按照0.1 mg N g-1干土添加到250 g土壤中，混合均匀放入580ml梅森瓶，每处理3次重复。将培养瓶置于人工气候室，20±1℃，黑暗条件培养，人工补水保持土壤含水量在最大持水量的50％。在培养的第1、3、7、15、28、42和56 d破坏性取样，测定土壤中氨基酸组分和含量，无机氮和微生物N含量。
　　为研究肥料对细菌和真菌群落结构的影响，培养结束时用PCR-DGGE的方法分别以16S和18SrDNA为目的片段研究细菌和真菌群落。将DGGE图谱中的DNA目的条带测序后得到群体结构的分类信息。培养过程中测定微生物群体，脱氢酶活性和呼吸作用的变化用以评价各处理对土壤质量的影响和肥料降解的动态变化。
　　为了解有机土壤和所添加肥料对固氮能力的影响，采用灵敏度高的乙炔还原法（ARA）周期性测定土壤培育过程中固氮酶活性。同时，测定其它土壤理化参数和生物参数以便确定对固氮能力影响最大的参数因子。培养结束时以 nifH为目的片段采用DNA-DGGE的方法分析土壤的固氮菌群落。
　　主要研究结果如下：
　　（1）DGGE图谱聚类分析表明，在温室种植模式中，有机生产管理的方式影响微生物群落结构，但是在露地种植模式下无此现象，从全碳的含量与微生物群落结构的相关性可以看出，两种种植模式下施肥量的差异是造成该现象的主要原因。结果表明，定量 PCR表明有机管理方式增加了固氮细菌的丰度和活性。在有机管理模式下和相对温暖的月份，可溶性有机氮（SON）含量较高，并与固氮细菌呈现了较好的相关性。图谱中鉴定出的序列主要归属于固氮细菌、β-变性菌门、γ-变性菌门和α-变性菌门。其中24个条带与Pseudomonas stutzeri相似，8个条带与Azoarcus spp.相似。研究结果表明栽培模式可以改变季节和有机管理对固氮细菌影响的程度，大棚栽培可以显著加强有机管理方式对固氮细菌的影响。同时，有机管理方式可以加强季节温度对固氮细菌丰度和活性的影响从而增加生物固氮速率。同时，土壤DNA和RNA的联合分析也给固氮菌群落提供了综合的描述。
　　（2）土壤DNA指纹图谱表明，真菌群落根据管理方式和栽培模式的不同而不同，但是cDNA指纹图谱表明季节更显著影响真菌群落。土壤有机质、EC和铵态氮可以解释指纹图谱中观察到的条带差异。通过测序，常规土壤中的真菌多归属于Pythium ultimum，Alternaria spp.，Fusarium oxysporum，Sporisorium reilianum和Chaetomium globosum，有机土壤中的真菌多归属于Cordyceps gunnii，18S rDNA和18S rRNA测序结果显示它们之间仅有部分重叠。真菌数量以及活性的改变都说明了有机管理方式对土壤真菌群落产生了深远的影响。由于温室栽培而引起的真菌群落变化与增加的盐分有关，其导致了真菌生物量的减少并增加了细菌的活性。这暗示了有机管理方中真菌产生的有益影响，可能会由于温室栽培而减小。cDNA-DGGE图谱可以更加灵敏的观察到真菌群落的变化，并且是唯一发现了季节可产生影响的方法，这说明了在研究中将土壤DNA和RNA联合分析比单独以土壤DNA为分析对象可以获得更高的解析度，并由此发现真菌群落中没有被注意到的重要变化。
　　（3）土壤游离氨基酸库主要由丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸和缬氨酸组成。在土壤游离氨基酸的组分和浓度方面，有机和常规土壤没有显著差异。然而，碱性氨基酸组氨酸和赖氨酸仅仅存在于有机土壤，这可能与有机土壤有更多的土壤交换点有关。尿素可以显著的改变游离氨基酸的组分，但仅仅存在于有机土壤中，说明在有机土壤里尿素对微生物的群落结构或者是它们的代谢途径产生了影响。苜蓿和堆肥没有改变游离氨基酸的组分和浓度。与此相反，培养土壤15天后，秸秆显著的增加了游离氨基酸的含量，同时微生物生物量中的氮含量也增加了。在农业土壤中，即使在经过长期的有机管理方式，土壤中的游离氨基酸含量依然很低，并且主要成分稳定，但是一些肥料却能显著的改变游离氨基酸的组分和含量，而这又影响到氨基酸态氮在植物吸收利用N素过程中所起到的作用。因此，值得对影响土壤游离氨基酸组分和含量的控制机制做进一步研究。
　　（4）有机土壤中微生物生物量和脱氢酶酶活性较高。微生物生物量和脱氢酶酶活性对所添加肥料的响应，与肥料的种类以及土壤的管理背景有关。在有机土壤中，添加尿素会减少微生物生物量中的氮含量，但却在常规土壤中增加了微生物生物量的氮含量。添加苜蓿仅仅在常规土壤中增加了微生物生物量的氮含量。添加尿素没有影响脱氢酶的活性，但是在常规土壤和有机土壤中加入苜蓿后都增加了脱氢酶的活性。添加秸秆显著的增加了微生物生物量氮含量和脱氢酶的活性，但是有机堆肥对它们影响不大。有机和常规土壤中的细菌和真菌群落显著不同。虽然添加秸秆和苜蓿对真菌和细菌的结构产生了微小的影响，但是短期的施肥没有对微生物的群落产生大的影响。条带测序结果显示，细菌和真菌主要归属于γ-Proteobacteria，Firmicutes，Acidobacteria和Ascomycota。施肥影响土壤化学和生物特性，然而对于微生物群落结构的影响，长期的管理是必须的。研究结果表明，微生物特性对短期施肥的响应依赖于土壤管理的背景，这些响应可能是由土壤背景微生物群落的差异驱动的。
　　（5）结果表明，有机土壤比常规土壤具有更强的潜在固氮能力。在有机土壤中，苜蓿和堆肥增加了潜在固氮能力，但是在土壤培养中的特殊时期，尿素和秸秆减小了潜在的固氮能力。与此相反，在常规土壤中添加苜蓿和尿素对潜在固氮能力没有产生显著的变化。溶解性有机碳和pH与潜在固氮能力显著相关。DGGE分析结果表明，在有机土壤和常规土壤中的微生物为简单的群落，且两者之间之间没有差别，同时肥料的加入也只有有限的影响，因此，群落结构的不同不能解释固氮潜力的不同。数据表明，固氮能力被种群的规模和活性驱动而不是由群落结构所驱动。这个研究说明了，对于大气的潜在固氮能力，有机生产系统要比常规生产系统强，同时添加苜蓿和有机堆肥可以显著增加这种潜力，然而需要进一步的研究去量化实际的固氮量。
　　综上所述，本文以菜田有机与常规栽培土壤为对象，以大棚和露地栽培为条件，在施用有机质或无机氮的情况下，系统分析了土壤氮形态、氨基酸组成、土壤理化性质、固氮细菌区系和固氮基因nifH的活性、微生物群落构成等，发现：有机条件下SON、总FAA和硝态氮含量、固氮细菌的丰度和nifH的活性、真菌多样性、微生物生物量和脱氢酶活性等均显著高于常规土壤。研究了在不同栽培模式（大棚和露地）中，有机蔬菜生产系统的土壤固氮菌群落结构多样性；有机生产系统中有活性的nifH-harboring bacteria的丰度较高，具有固氮潜能，结果均表明有机生产土壤具有最大固定大气N的潜能。发现了土壤氨基酸在农田土壤碳氮循环和对植物供氮过程中具有重要作用，肥料显著影响土壤游离氨基酸浓度和成分，该影响进一步说明需要建立植物总氮需求与氨基酸氮吸收之间的联系。

目录

封面

声明

答辩决议书

致谢

中文摘要

英文摘要

目录

Chapter 1-General Introduction

1.1 Background information

1.2 Study goal

1.3 Specific objectives

1.4 Research framework

Chapter 2-Literature review

2.1 Sustainable agriculture

2.2 Nitrogen

2.3 Nitrogen fertilization management

2.4 The role of the soil microbial community in N cycling

2.5 Microbial processes and N availability

Chapter 3-Analysis of the occurrence and activity of diazotrophic communities in horticultural soils

3.1 Introduction

3.2 Material and Methods

3.3 Results

3.4 Discussion

3.5 Conclusion

Chapter 4-rDNA-and rRNA-based analysis of the fungal community in vegetable cultivated soil

4.1 Introduction

4.2 Material and Methods

4.3 Results

4.4 Discussion

4.5 Conclusion

Chapter 5-Amino acid composition of agricultural soils with different management histories after nitrogen fertilization

5.1 Introduction

5.2 Material and Methods

5.3 Results

5.4. Discussion

5.5. Conclusion

Chapter 6-Microbial biomass and composition in soil under different management history and the effect of fertilization

6.1 Introduction

6.2 Material and methods

6.3 Results

6.4 Discussion

6.5 Conclusion

Chapter 7-Potential N-fixation in organic and conventional horticultural soil and the effect of fertilizer addition

7.1 Introduction

7.2 Material and methods

7.3 Results

7.4 Discussion

7.5 Conclusion

Chapter 8-Major findings and Outlook

8.1 Major findings

8.2 Outlook

参考文献

List of publications