血清（血浆）miRNA对慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断价值的临床研究

摘要

第一章慢性乙型肝炎肝纤维化进程中差异表达循环miRNA的筛选
　　目的：本研究旨在寻找在慢性乙型肝炎肝纤维化各分期分组之间差异表达的血清（血浆）miRNA,为发现乙肝肝纤维化非创伤性诊断标志物及组建诊断模型奠定基础。
　　方法：研究材料为2012年7月-2013年12月间于上海交通大学附属第一人民医院行肝活检的慢性HBV感染患者血浆样本共50例（肝纤维化Scheuer分期S0-S4期各10例），提取血清（血浆）miRNA，并采用安捷伦公司人类miRNA芯片v18.0（Affymetrix Human v18.0）进行miRNA芯片杂交、扫描及数据提取。应用Quantile归一化法进行数据标准化后，主要采用独立样本t检验、ANOVA分析S0-S4组间、非显著性肝纤维化和显著性肝纤维化组间（S0-1/S2-4）、轻度肝纤维化和重度肝纤维化(S0-1/S3-4)组间 miRNA的差异表达。
　　结果：从芯片结果来看，S1-S4组分别与S0组比较,差异倍数大于2倍的miRNA共有140个（p<0.05）；在非显著性肝纤维化(S0-1)和显著性肝纤维化(S2-4)两组间差异表达达2倍以上的miRNA共有11个；重度纤维化组（S3-4）与轻度纤维化组（S0-1）相比，差异倍数达2倍以上的miRNA共有7个。因hsa-miR-1225-3p，hsv1-miR-H7-3p，hsa-miR-1238-3p，hsa-miR-3162-3p，hsa-miR-4721在轻度纤维化/明显纤维化组间表达倍数达3-5倍以上，且在不同的分组比较中均有差异，我们拟定上述miRNAs作为候选差异miRNA进行进一步的实时荧光定量验证实验。
　　结论：采用血清（血浆）miRNA芯片技术，我们发现miRNA表达谱的变化与肝纤维化分期密切相关，该研究为肝纤维化无创性诊断物的开发和应用提供了可能。
　　第二章慢性乙型肝炎肝纤维化相关差异表达miRNA的验证、诊断模型的建立及评估
　　目的：本研究旨在对miRNA芯片实验筛选的5个miRNA进行进一步验证，同时应用logistic回归方法优化组合各miRNA，建立显著性肝纤维化（S2-4）的预测诊断模型，评估该模型诊断效能并进一步与其他预测模型（APRI评分、Forn's评分、FIB-4评分、S指数）在预测诊断价值方面进行比较。
　　方法：本部分的研究材料入选标准同第一部分实验，均来自上海交通大学附属第一人民医院，收集时间为2012年7月至2014年12月间，病例组血清（血浆）共83份（SO组10份，S1组15份，S2组13份，S3组10份，S4组10份，肝硬化代偿组13份，肝硬化失代偿组12份）及正常对照组血浆（血清）标本20份进行实时荧光定量PCR验证实验。本阶段我们用Taqman qRT-PCR方法在103份样本中验证5个候选miRNA的稳定性，获得5个miRNA相对表达量后，采用独立样本t检验分析其在非显著性肝纤维化(S0-1)/显著性肝纤维化(S2-4)、肝纤维化/肝硬化组、代偿期肝硬化/失代偿期肝硬化组间的差异，从结果中进一步筛选目标miRNA，并使用logistic回归模型对其进行优化组合获得诊断模型，绘制诊断模型的ROC曲线及计算AUROC来判断该模型的诊断价值，并同时与诊断模型Forns指数、APRI指数、FIB-4评分以及S指数进行诊断效能的比较。
　　结果：5个候选miRNA在显著性肝纤维化组/非显著性肝纤维化组组间表达水平有显著性差异（p<0.05），hsa-mir-1225-3p，hsa-mir-1238，hsa-miR-3162-3P，hsa-miR-4721，hsa-miR-H7上调倍数分别为：10、10.23、16、4.85、4.7，与芯片结果基本相符，但上述miRNA对肝纤维化/肝硬化组、代偿期肝硬化/失代偿期肝硬化组间区分度不高。我们通过建立受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC曲线),进行计算ROC曲线下面积(Area Under Curve，AUC)对每个 miRNA的诊断能力进行判断，得到 miRNA-3162，miRNA-1225，miRNA-1238，miRNA-4721，miRNA-H7的AUROC面积分别为0.899,0.852,0.656,0.650,0.650，可见miRNA-3162，miRNA-1225对明显肝纤维化诊断效能极强，而miRNA-1238，miRNA-4721，miRNA-H7诊断价值较为一般。为进一步优化诊断效能，我们对上述5个miRNA进行逐步logistic回归，得到诊断方程式MiR-5=1.115*miR1225+0.157*miR1238+6.256*miR3162+0.072*miR4721-0.831miRH7-2.729。同样通过 ROC曲线下面积评估其诊断效能,其区分明显肝纤维化和轻度肝纤维化的AUC为0.909，诊断效能优于Forns指数、APRI指数、FIB-4评分和S指数等预测模型及单个差异miRNA。
　　结论：采用Taqman qRT-PCR技术，我们验证hsa-mir-1225-3p，hsa-mir-1238，hsa-miR-3162-3P，hsa-miR-4721，hsa-miR-H7是一组新的有前景的非创伤性肝纤维化分子诊断标志物。诊断方程式MiR-5能十分高效的将显著性肝纤维化和非显著性肝纤维组区分开来,保持较高的敏感度、特异度，且优于现存的其他无创性诊断模型（Forns指数、APRI指数、FIB-4评分以及S指数）及单个差异miRNA。

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第一章 慢性乙型肝炎肝纤维化进程中差异表达循环miRNA的筛选

1.1 引言

1.2 材料与方法

1.2.1 材料

1.2.2 方法

1.3 结果

1.4 讨论

第二章 慢性乙型肝炎肝纤维化相关差异表达miRNA的验证、诊断模型建立及评估

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3结果

2.3.1研究对象的一般特征

2.3.2总RNA质量检测

2.3.3实时荧光定量试验结果

2.3.4 利用目标miRNA qRT-PCR结果预测肝纤维化程度

2.3.5诊断模型

2.3.6 诊断效力的评估

2.3.7 MIR-5预测模型的界值选择

2.3.8生物信息学分析

2.4 讨论

参考文献

附录一 综述：乙肝及丙肝肝纤维化、肝硬化的诊断与治疗

附录二 在校期间发表论文

致谢