OCT4介导FSH通过ERK1/2信号通路诱导的上皮性卵巢癌上皮间质转化和侵袭作用

摘要

（FSH）在上皮性卵巢癌的形成中具有重要作用。但是，FSH在卵巢癌发生和发展中的分子机制仍不清楚。OCT4（Octamer-binding transcription factor4）在人类恶性肿瘤的发生和发展中扮演重要角色。我们之前的研究发现OCT4在卵巢癌组织表达与肿瘤分级相关，并且发现OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌的凋亡抑制。然而，OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌转移和侵袭中的作用尚不清楚。因此，在目前的研究中，我们想确定OCT4是否参与FSH诱导的上皮性卵巢癌的转移和侵袭。我们研究发现FSH能够诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化和侵袭。我们还发现FSH能够以剂量依赖和时间依赖的方式上调OCT4蛋白和mRNA的水平。除此之外，FSH刺激上调FSH受体（FSHR）的表达，敲除FSHR表达阻断了FSH诱导的OCT4表达的增加。预先使用MAPK/ERK信号通路阻断剂U0126处理卵巢癌细胞，抑制了FSH诱导的OCT4和Snail表达的上调。我们进一步研究发现使用siRNA干扰敲除OCT4表达阻断了FSH诱导的上皮性卵巢癌细胞中Snail和N-cadherin表达的上调，E-cadherin的下调和细胞形态学的改变。而且，我们还发现OCT4介导FSH诱导的卵巢癌迁移和侵袭能力的增加。总之，我们的研究表明OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌的迁移和侵袭中具有重要作用，OCT4有可能成为上皮性卵巢癌的一个治疗靶点。
　　第一部分FSH诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化和侵袭
　　目的：FSH刺激上皮性卵巢癌细胞株后，观察其形态学变化和侵袭能力改变，并检测上皮间质转化相关标志分子表达的变化。
　　方法：应用不同浓度（0,5,25,50,100mIU/ml）的卵泡刺激素处理上皮性卵巢细胞株Hey和Ho8910，通过Western blotting技术检测上皮间质转化相关标志分子表达的情况。使用不同浓度（0和50mIU/ml）的卵泡刺激素处理上皮性卵巢细胞株 Hey和Ho8910，观察两种细胞株 FSH刺激后细胞形态学的变化，通过Transwell侵袭实验检测FSH刺激前后细胞侵袭能力的变化。
　　结果：
　　（1）随着FSH浓度的不断增加，上皮细胞标志蛋白 E-cadhenrin表达逐渐下调，间质细胞标志蛋白N-cadherin表达逐渐上调，在FSH浓度为50mIU/ml时，下调E-cadherin和上调N-cadherin作用最为显著。从分子表达水平说明FSH能够诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化。
　　（2）使用50mIU/ml浓度的FSH处理两种细胞，可以明显观察到两种细胞从紧凑的椭圆形变成稀疏的长梭形转变。从形态学上说明FSH能够诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化。
　　（3）使用50mIU/ml浓度的FSH处理两种细胞，通过Transwell侵袭实验结果表明FSH可以诱导上皮性卵巢癌侵袭。从功能学方面说明FSH能够诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化。
　　结论：FSH具有诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化和促进其侵袭的作用。
　　第二部分FSH通过作用于FSHR上调OCT4的表达
　　目的：研究卵泡刺激素（FSH）对OCT4表达的调控作用。
　　方法：使用不同浓度的（0,5,25,50,100mIU/ml）的卵泡刺激素刺激上皮性卵巢癌细胞株Hey和Ho8910，使用Western blotting检测FSHR和OCT4的蛋白的表达情况，RT-qPCR检测FSHR在mRNA表达情况。使用50mIU/ml的FSH分别刺激两种细胞株不同时间（0,0.5,1,3,6,12,24h），同样使用Western blotting检测OCT4的蛋白的表达情况。使用FSHR的siRNA沉默 FSHR的表达，应用Western blotting和RT-qPCR检测FSHR和OCT4表达的变化情况。
　　结果：
　　（1）在一定浓度和时间范围内，FSH能显著上调上皮性卵巢癌细胞 Hey和Ho8910中OCT4的蛋白表达，而且以剂量依赖和时间依赖的方式，在FSH浓度为50mIU/ml作用最明显。
　　（2）在一定浓度范围内，FSH能显著上调上皮性卵巢癌细胞 Hey和Ho8910中FSHR的mRNA和蛋白表达，而且以剂量依赖的方式，在FSH浓度为50mIU/ml作用最明显。
　　（3）干扰FSHR表达后，阻断了FSH上调OCT4表达的作用。
　　结论：在一定浓度和时间范围内，FSH能够显著上调OCT4的蛋白表达水平。在一定浓度范围内，FSH能够上调FSHR的mRNA和蛋白表达水平，而且FSH通过作用于FSHR上调OCT4的表达。
　　第三部分ERK1/2信号通路参与FSH诱导的OCT4和Snail的表达
　　目的：探索FSH上调OCT4和Snail表达的信号通路。
　　方法：上皮性卵巢癌细胞 Hey和Ho8910各分为五组，分别为 Con，FSH，FSH+LY294002（PI3K/AKT信号通路阻断剂)，FSH+U0126(ERK1/2信号通路阻断剂)和FSH+NAC(ROS信号通路阻断剂)。使用Western blotting和RT-qPCR检测OCT4和Snail的表达。
　　（1）使用ERK1/2阻断剂 U0126阻断了 FSH诱导的OCT4表达的上调，PI3K/AKT信号通路阻断剂和ROS信号通路阻断剂未对 FSH诱导的OCT4表达产生影响。
　　（2）使用ERK1/2阻断剂 U0126阻断了 FSH诱导的Snail表达的上调，PI3K/AKT信号通路阻断剂和ROS信号通路阻断剂未对FSH诱导的Snail表达产生影响。
　　结论：FSH通过ERK1/2信号通路上调OCT4和Snail的表达。
　　第四部分OCT4是FSH诱导的上皮间质转化所必需的
　　目的：明确OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌上皮间质转化中的作用。
　　方法：上皮性卵巢癌细胞 Hey和Ho8910各分为四组，分别为 Con+si-Con，FSH+si-Con，Con+si-OCT4和FSH+si-OCT4。以RNA干扰技术敲除两种细胞中OCT4的表达，同时使用FSH刺激并设立对照。用倒置显微镜观察干扰 OCT4后，FSH刺激两种细胞后细胞形态学的变化。使用Western blotting和RT-qPCR检测干扰 OCT4后对 FSH诱导的上皮间质转化相关指标 Snail、E-cadherin和N-cadherin表达水平的影响。
　　结果：
　　（1）干扰OCT4的表达后，FSH对上调Hey和Ho8910细胞中Snail蛋白表达水平明显受到抑制。
　　（2）干扰OCT4的表达后，FSH对Hey和Ho8910细胞中下调E-cadherin和上调N-cadherin的作用被阻断。
　　（3）从形态学上，干扰OCT4的表达后，FSH诱导的上细胞向间质细胞的转化作用被阻断。
　　结论：OCT4是FSH诱导的上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化所必需的。
　　第五部分OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌转移
　　目的：探讨OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌转移中的作用。
　　方法：上皮性卵巢癌细胞 Hey和Ho8910各分为四组，分别为 Con+si-Con、FSH+si-Con、Con+si-OCT4和FSH+si-OCT4。以RNA干扰技术敲除OCT4在两种细胞中表达，同时使用FSH刺激并设立对照。使用划痕实验和Transwell侵袭实验检测干扰OCT4后，FSH对两种细胞迁移和侵袭能力的影响。
　　结果：
　　（1）划痕实验结果表明：干扰OCT4表达以后，FSH诱导的上皮性卵巢癌Hey和Ho8910细胞迁移能力增加受到明显抑制，差异具有统计学意义。
　　（2）Transwell侵袭实验结果表明：干扰OCT4表达以后，FSH诱导的上皮性卵巢癌Hey和Ho8910细胞侵袭作用被抑制。
　　结论：在上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910，OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌细胞迁移和侵袭。

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中英文名词对照

前言

第一部分FSH诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化和侵袭

1.1 实验材料和方法

1.2 结果

1.3 讨论

第二部分FSH通过作用于FSHR上调OCT4的表达

2.1 实验材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三部分ERK1/2信号通路参与FSH诱导的OCT4和Snail的表达

3.1 实验材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四部分OCT4是FSH诱导的上皮间质转化所必需的

4.1 实验材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

第五部分OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌转移

5.1 实验材料和方法

5.2 结果

5.3 讨论

结论

参考文献

综述:OCT4在妇科肿瘤中研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢