人卵巢癌细胞SKOV3中侧群细胞的分离和特性研究

摘要

研究背景和目的：
　　上皮性卵巢癌是最常见的卵巢恶性肿瘤，发病机理不明，其占卵巢恶性肿瘤的85-90％，5年生存率约30%左右。通过满意的肿瘤细胞减灭术联合术后化疗可使卵巢癌患者的预后明显改善，但5年的复发率仍高达70%，且复发的卵巢癌往往出现耐药性而治疗效果较差。既往研究显示肿瘤干细胞（CSCs）可能是导致如此高复发率的一个潜在原因。机体干细胞具有自我更新及多向分化的能力，此外其在正常组织中常处于休眠状态，在机体需要时重新进入细胞周期增殖替代细胞或组织修复。CSCs是指实体肿瘤内部少量具有自我更新能力、能生长出含有异质性细胞群的细胞。因此对CSCs的研究具有重要意义，分离和鉴定是CSCs研究的第一步，但CSCs缺乏统一的特异性标记，故分离和鉴定成为难点，国外部分学者通过采用流式细胞分选术在卵巢癌细胞中检测分选出侧群细胞（SP细胞）及非侧群细胞（NSP细胞），研究其干细胞属性，发现SP细胞能产生SP、NSP子代细胞，其与NSP细胞相比具有较强致瘤能力和耐药性，进一步研究发现该类细胞高表达CD44，nestin，ABCG2等具有一定特异性干细胞分子。
　　虽然规范化外科手术联合放化疗对治疗卵巢癌具有较好的效果，但针对肿瘤复发及化疗不敏感的患者依然需要探索进一步的治疗方法。故针对肿瘤标志物及信号通路的分子靶向技术逐渐成为研究热点。许多研究已证实各种实体瘤当中存在着肿瘤干细胞，探索上皮性卵巢癌细胞表面干细胞标志物的表达情况将对未来的治疗研究具有积极意义。
　　方法：
　　将卵巢癌细胞株SKOV-3培养传代后，胰酶消化成单细胞悬液，经Hoechst33342荧光染料处理后使用流式细胞仪根据细胞的不同染色情况区分出 SP细胞和non-SP细胞，并观察研究顺铂（CDDP）对SP及non-SP细胞细胞周期及细胞活力的影响。
　　具体实验步骤如下：
　　1，应用流式细胞术检测SP及non-SP细胞中CD44蛋白的表达量。
　　2，采用Real-time PCR方法分析SP及non-SP细胞中ABCG2和Nestin的mRNA表达情况。
　　3，采用平板克隆形成实验检测SP及non-SP细胞体外克隆形成能力。
　　4，分析CDDP对SP及non-SP细胞细胞周期及细胞活力的影响。
　　5，计量资料用means±SEM（均数加减标准误）描述，经SPSS12.0统计软件处理，采用方差分析，当P<0.05时认为差异有统计学意义；当P>0.05时，差异无统计学意义。每组结果均检验3次
　　结果：
　　1，CD44标记的SP和non-SP细胞MFI值显著升高，并且SP细胞的MFI值更高于non-SP细胞，提示SP细胞的CD44抗原表达更为活跃(P<0.05)。
　　2，SP和non-SP细胞中ABCG2和Nestin的相关mRNA的表达结果提示分选的SP细胞中ABCG2和Nestin的表达显著高于non-SP细胞(P<0.05)。
　　3，体外克隆形成能力实验提示SP细胞的克隆形成能力远强于non-SP细胞，该结果提示SP细胞拥有更活跃的增殖能力。
　　4，CDDP处理试验组中，SP细胞比non-SP细胞表现出更高的细胞活性，提示SP细胞对化疗药物具有更强的抗药性。
　　结论：
　　肿瘤干细胞标志物CD44及肿瘤干细胞相关基因（ABCG2和Nestin）的高表达，均证实SKOV3细胞中分离出SP细胞具有肿瘤干细胞的特征。分离出的SP细胞在肿瘤细胞克隆形成能力实验中也表现出较强的再生和增殖能力。另外，通过观察顺铂对SP细胞细胞周期的影响，发现SP细胞对化疗药物存在较强的耐药性。故对SP细胞的研究可能成为卵巢癌治疗的重要环节。

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引言

1材料和方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

2结果

2.1 SP细胞的分离

2.2 细胞免疫组化分析

2.3 干细胞相关基因表达分析

2.4 克隆形成能力实验

2.5 顺铂作用下SP细胞的活力及顺铂-IC50

2.6 顺铂对于SP细胞和non-SP细胞的作用

3讨论

4全文结论

参考文献

综述: 卵巢癌干细胞特性的研究进展及现状

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录和承担的科研项目