重金属汞、铜、铅、镉的酶联免疫吸附快速检测方法研究

摘要

随着近年来工农业的迅猛发展，环境中的重金属污染日趋严重。重金属污染问题受到了人们普遍关注，而重金属检测分析和监测的机构承担的相关任务越来越重，对检测的质量和速度要求也越来越高。目前重金属的检测方法主要以原子吸收等仪器分析为主，这些方法可实现准确、较灵敏地定量分析，但其不足之处在于样品前处理过程复杂、仪器配置要求高、价格昂贵、花费较大、周期偏长等。因此，建立简便、可靠、快速有效的重金属检测分析方法，用于定量检测环境介质中的重金属，具有重要的研究意义和实用价值。
　　本文以研究建立快速检测环境中四种重金属（汞、铜、铅、镉）的酶联免疫分析（ELISA）方法为目标，设计合成了这四种重金属的半抗原，并通过结合载体蛋白合成人工抗原，然后免疫动物获得了相关特异性抗体，基于制备的抗体，研究确立了四种重金属的间接竞争酶联免疫分析（IC-ELISA）方法。所建立的方法为重金属的快速检测提供了技术手段，并具一定的推广应用前景。主要研究结果如下：
　　1．以青霉素G钠盐和谷胱甘肽作为中间化合物，分别合成重金属汞的半抗原青霉烯酸硫醇汞盐（Hg-MPA）和汞-谷胱甘肽（Hg-GSH），将载体蛋白与半抗原偶联的方法选择碳二亚胺法，制备人工抗原（青霉烯酸硫醇汞盐-牛血清白蛋白(Hg-MPA-BSA），青霉烯酸硫醇汞盐-卵清蛋白（Hg-MPA-OVA）和汞-谷胱甘肽-牛血清白蛋白（Hg-GSH-BSA）。分别通过紫外光谱扫描、红外光谱、圆二色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、三硝基苯磺酸钠法（TNBS）、考马斯亮蓝法（Bradford法）和电感耦合等离子发射光谱法（ICP-AES）表征验证了其分子结构。然后将人工抗原 Hg-MPA-BSA和Hg-GSH-BSA分别免疫新西兰大白兔制得重金属汞多克隆抗体，对抗血清进行效价测定，抗血清最终效价均在1：32000以上。将制备的多克隆抗血清用于研究建立重金属汞的间接竞争酶联免疫分析方法，优化并确立最佳ELISA分析条件。以抗原Hg-MPA-BSA制备的抗体最适抗原-抗体反应条件为：包被抗原2.0μg/mL，抗体稀释度1：10000；以抗原Hg-GSH-BSA制备的抗体最佳抗原-抗体反应条件为：包被抗原2.5μg/mL和抗体稀释度1：8000。最终确立的最佳包被缓冲液为碳酸盐缓冲液（CB，pH9.6）；二抗最佳稀释度为1：5000；选择5％甘氨酸作为封闭液。以抗原Hg-MPA-BSA制备的抗体构建IC-ELISA，以作为抑制物的汞标准溶液对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制得IC-ELISA检测重金属汞的标准曲线，用直线拟合后得回归方程y=37.38x-30.85，相关系数为0.9869，汞的检测范围为0.01μg/mL~100μg/mL，检测下限为12.30 ng/mL，水样中重金属汞的加标回收率为76.0%～124.0%，与ICP-AES方法检测结果准确度相当。特异性试验表明，除了与镉存在较低的交叉反应率外，与其他金属离子（Cu2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+）交叉反应率都小于0.001%。
　　2．以青霉素G钠盐为中间化合物，合成重金属铜的半抗原（青霉烯酸硫醇铜盐(Cu-MPA），将半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联，制备人工抗原（青霉烯酸硫醇铜盐-牛血清白蛋白(Cu-MPA-BSA）和青霉烯酸硫醇铜盐-卵清白蛋白(Cu-MPA-OVA），采用紫外、红外光谱、圆二色谱和电感耦合等离子发射光谱等方法，表征鉴定抗原结构；然后用该人工抗原免疫新西兰大白兔获得重金属铜多克隆抗体，血清的效价最高达1：128000。将该抗体用于建立重金属铜的IC-ELISA检测方法，并优化确立最佳ELISA检测条件。确立最佳包被抗原浓度为2.0μg/mL，抗体稀释度为1：8000，最佳包被缓冲液为碳酸盐缓冲液（CB，pH9.6），5%甘氨酸作为封闭液，二抗最佳稀释度为1：5000。以铜标准溶液对数值为横坐标，抑制率为纵坐标绘制得间接竞争ELISA法检测重金属铜的标准曲线，用直线拟合后得回归方程y=22.10x-9.01，相关系数为0.9768，铜的检测范围为0.01μg/mL~100μg/mL，检测下限为7.29 ng/mL。加标回收率试验结果表明，IC-ELISA方法检测水溶液中铜的加标回收率在78.0%～122.0%。交叉反应试验结果，该方法与其他测试金属离子（Hg2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+和Ni2+）的交叉反应率均低于0.1%，表明该方法具有很高的的特异性。
　　3．以p-NH2-Bn-DTPA为双功能螯合剂，戊二醛为交联剂，偶联p-NH2-Bn-DTPA和载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)，然后与铅和镉离子进行螯合反应，制备重金属铅和镉的人工抗原（Pb-p-NH2-Bn-DTPA-KLH和Cd-p-NH2-Bn-DTPA-KLH）。经紫外光谱、红外光谱、圆二色谱、SDS-PAGE和电感耦合等离子发射光谱等技术表征鉴定。以制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠，获得重金属铅和镉的多克隆抗体，血清的效价分别大于1：20000和1：10000。在优化确定IC-ELISA的工作条件后建立铅和镉的IC-ELISA检测方法。在最佳条件下检测铅和镉，标准曲线直线拟合后得铅的回归方程为y=29.81x-14.49，相关系数为0.9736，镉的回归方程为y=36.93x-33.41，相关系数为0.9918。铅和镉的检测范围为0.01μg/mL~100μg/mL，铅的检测下限为6.63 ng/mL，镉的检测下限为14.98 ng/mL。加标回收率试验结果表明，铅和镉的IC-ELISA方法的添加回收率分别为79.4%～126.0%和86.2%～144.0%。交叉反应试验结果，铅的IC-ELISA方法与其他的供试金属（Cu2+、Cd2+、Hg2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+）交叉反应率都小于0.001%；镉的IC-ELISA方法除了汞有5.8%的交叉反应率外，其他的供试金属交叉反应率也都小于0.001%，方法的特异性较好。
　　建立的四种重金属（汞、铜、铅和镉）的酶联免疫分析（IC-ELISA）方法，具有高灵敏、高通量、高特异和操作简便等优点。水中样品IC-ELISA检测结果与ICP-AES方法检测结果基本一致，表明建立的分析方法可用于环境样品中汞、铜、铅和镉等重金属的定量检测。

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术语和缩略语表

第一章 前言

1.1 重金属污染对环境的影响

1.2 重金属快速检测技术研究进展

1.3 重金属人工抗原的制备

1.4重金属免疫学检测方法研究进展

1.4 研究背景及意义

1.5研究内容及技术路线

第二章 以青霉素G钠盐和谷胱甘肽为中间化合物合成汞的半抗原、人工抗原

2.1 引言

2.2实验试剂和仪器

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5本章小结

第三章 抗汞多克隆抗体的制备及间接竞争酶联免疫吸附法（IC-ELISA）确立

3.1实验试剂和仪器

3.2实验方法

3.3 结果与分析

3.4小结

第四章 铜人工抗原制备及其IC-ELISA检测方法研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3结果与讨论

4.4 小结

第五章 基于p-NH2-Bn-DTPA双功能螯合剂的铅和镉人工抗原合成及其IC-ELISA检测方法研究

5.1 引言

5.2实验试剂和仪器

5.3 实验方法

5.4结果与分析

5.5小结

第六章 总结与展望

6.1总结

6.2创新点

6.3展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及所获专利