中枢神经系统Akt信号通路参与大鼠乳腺癌骨转移疼痛的研究

摘要

目的：
　　研究中枢神经系统Akt信号通路对大鼠乳腺癌骨转移疼痛中的作用。观察鞘内注射Akt抑制剂GSK690693对胫骨癌痛大鼠痛觉行为的影响，及脊髓中磷酸化Akt（p-Akt）表达的变化；探讨Akt信号通路在骨癌痛大鼠痛觉过敏产生中的作用及其脊髓机理。
　　方法实验分为三个部分：
　　一．建立癌痛动物模型
　　1.癌痛动物模型的建立
　　将90只大鼠随机（采用随机数字表法）分为3组：癌痛模型组(A组60只)、假手术组(B组10只)、正常组(C组20只)。其中A组大鼠左侧胫骨髓腔内注入20μl Walker256细胞(1×108/ml)，B组大鼠左侧胫骨髓腔内注入20μl生理盐水，其余操作同A组，C组做不给药处理。
　　2.评估癌痛动物模型，再分组
　　造模后第7天，根据大鼠一般情况（生长情况，体重变化）、行为学表现及影像学评估癌痛组大鼠造模是否成功，第7天从造模所有60只大鼠中筛选出30只。二．鞘内注射Akt抑制剂GSK690693对骨癌痛大鼠行为学的影响
　　1.再分组：实验开始第7天，A组成模的30只大鼠随机分为3组：癌痛组（A1组）、癌痛+NS组（A2组）、癌痛+抑制剂组（A3组），n=10。将正常组（C组）随机分为2组：空白对照组（C1组）、空白+抑制剂组（C2），n=10。A3组和C2组分别在第13、14、21鞘内注射Akt抑制剂GSK690693，A2组在第13、14、21鞘内注射等量生理盐水，A1组、B组、C1组均做不给药处理。
　　2.在第0、7、14、21天，观察大鼠一般情况，记录大鼠体重，分别检测大鼠机械性缩足阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）和热缩腿潜伏期（thermal withdrawal latency,TWL），统计分析大鼠的体重变化、MWT、TWL。
　　三．鞘内注射Akt抑制剂GSK690693对骨癌痛大鼠脊髓p-Akt表达的影响
　　1.免疫组化方法检测脊髓p-Akt水平
　　建模后第21天取大鼠脊髓L4-L6区段，采用免疫组化染色法观察脊髓中p-Akt的表达情况。
　　2．Western blot方法检测脊髓p-Akt水平
　　建模后第21天取大鼠脊髓L4-6区段，采用Western blot半定量检测脊髓中p-Akt的表达情况。
　　结果：
　　1.大鼠的疼痛行为学表现、影像学X线平片、胫骨组织学观察结果表明，本实验成功建立Walker256大鼠乳腺癌胫骨癌痛模型。
　　2.造模手术所致创伤影响大鼠生长，创伤修复后又能恢复正常。鞘内注射生理盐水对大鼠生长无明显影响；癌痛模型组鞘内注射抑制剂后大鼠体重无逆转趋势，提示肿瘤影响大鼠生长，鞘内注射抑制剂对大鼠生长无明显影响，不能改善大鼠的一般情况。
　　3.手术创伤影响大鼠MWT数值，诱导大鼠产生痛觉过敏，创伤修复后又能恢复正常；鞘内注射生理盐水对大鼠MWT无明显影响，不能改变大鼠机械痛觉敏感性；GSK690693可以抑制中枢神经系统Akt信号通路，抑制癌痛，降低机械痛觉过敏，改善疼痛。
　　4.手术创伤影响大鼠TWL数值，诱导大鼠产生痛觉过敏，待创伤修复后,TWL数值逐渐升高，趋于正常；鞘内注射生理盐水对大鼠TWL无明显影响，不能改变大鼠热痛觉敏感性；GSK690693可以抑制中枢神经系统Akt信号通路，抑制癌痛，降低热痛觉过敏，改善大鼠疼痛。
　　5.鞘内注射GSK690693对大鼠骨质结构改变无明显影响，不能逆转大鼠骨质破坏。
　　6.Walker256乳腺癌胫骨癌痛模型大鼠脊髓p-Akt水平明显升高，鞘内注射Akt抑制剂GSK690693后，脊髓中的p-Akt水平降低。
　　结论：
　　1.运用Walker256乳腺癌细胞可以成功建立大鼠胫骨癌痛模型。
　　2.肿瘤影响大鼠生长，鞘内注射Akt抑制剂GSK690693对大鼠生长无明显影响，不能改善大鼠的一般情况。
　　3. GSK690693可以抑制中枢神经系统Akt信号通路，抑制癌痛，降低骨癌痛大鼠的机械缩足阈值，降低热缩腿潜伏期，改善大鼠疼痛。
　　4．骨癌痛大鼠脊髓p-Akt表达增加，鞘内注射Akt抑制剂可降低脊髓p-Akt的表达，Akt信号通路参与了骨癌痛的中枢敏化，在大鼠骨癌痛发生发展过程中起着重要作用。

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第一章 绪论

1.1疼痛概述

1.2癌性疼痛

1.3骨癌痛

1.4疼痛的传导通路

1.5 PI3K/Akt信号通路

1.6乳腺癌骨转移动物疼痛模型

1.7 技术路线

第二章 大鼠胫骨癌痛模型的建立

2.1引言

2.2 材料与方法

2.3 实验结果

2.4讨论

2.5小结

第三章 鞘内注射Akt抑制剂GSK690693对骨癌痛大鼠行为学的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 鞘内注射Akt抑制剂GSK690693对骨癌痛大鼠脊髓p-Akt表达的影响

4.1 引言

4.2材料与方法

4.3实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

学术论文及科研成果附录