冬凌草甲素通过增强细胞自噬活性提高NVP-BEZ235对神经母细胞瘤的抗肿瘤效应

摘要

研究背景和目的:
　　PI3K/Akt/mTOR信号通路在神经母细胞瘤中存在异常激活，并与预后密切相关；然而，NVP-BEZ235作为新型PI3K/mTOR双靶点抑制剂，单独应用并不能有效诱导神经母细胞瘤细胞凋亡。为增强 NVP-BEZ235的抗肿瘤效应，充分发挥其在神经母细胞瘤治疗中的潜在应用价值，有必要探索以 NVP-BEZ235为基础的联合化疗方案。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是从中草药冬凌草中提取出来的贝壳杉烯二萜类天然化合物，可以作为一种辅助药物显著增强吉西他滨和伊马替尼等多种化疗药物的抗肿瘤效应。本研究采用冬凌草甲素与 NVP-BEZ235联合方案处理神经母细胞瘤细胞并构建裸鼠皮下移植瘤模型，观察该联合方案在体内外水平对神经母细胞瘤的抗肿瘤效应，并探讨其可能的分子机制。
　　研究方法:
　　1. CCK-8法和免疫印迹法分别检测NVP-BEZ235对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响；流式细胞术和免疫印迹法进一步探讨 NVP-BEZ235抑制神经母细胞瘤细胞增殖的机制。
　　2. CCK-8、AO/EB双荧光染色和免疫印迹法检测冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用在体外水平对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响；Ki-67免疫组化和TUNEL实验检测冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用在体内水平对神经母细胞裸鼠移植瘤增殖和凋亡的影响。
　　3.免疫印迹法检测冬凌草甲素与NVP-BEZ235单独或联合应用对神经母细胞瘤细胞自噬活性的影响。以pLKO.1为载体，构建针对自噬基因Beclin-1的shRNA干扰质粒，利用293T细胞包装生产病毒液，感染SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞，免疫印迹法验证靶基因的沉默效果；AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用对Beclin-1基因敲减的SHSY-5Y细胞凋亡的影响，免疫印迹法进一步检测冬凌草甲素与 NVP-BEZ235联合应用对 Beclin-1基因敲减的SHSY-5Y细胞自噬和凋亡相关蛋白表达水平的影响。
　　研究结果:
　　1. NVP-BEZ235可以显著抑制神经母细胞瘤细胞增殖，并且呈明显的时间和剂量依赖性；但其并不能有效诱导神经母细胞瘤细胞凋亡。流式细胞术显示神经母细胞瘤细胞经NVP-BEZ235处理后G0/G1期细胞数显著增多，S期和G2/M期细胞数明显减少；且G1期细胞周期素cyclinD1和cyclinE1表达减少。
　　2.冬凌草甲素和NVP-BEZ235联合应用可以更显著地抑制神经母细胞瘤细胞增殖，并有效诱导神经母细胞瘤细胞凋亡；冬凌草甲素和 NVP-BEZ235联合用药组裸鼠移植瘤体积和质量相对于对照组和单药处理组明显减小，Ki-67阳性增殖细胞比例显著降低，TUNEL阳性凋亡细胞比例明显增多。
　　3.冬凌草甲素和NVP-BEZ235联合应用诱导神经母细胞瘤细胞凋亡伴随着细胞自噬活性的显著增强；shRNA干扰自噬基因 Beclin-1表达后，神经母细胞瘤细胞整体自噬活性显著降低，细胞经冬凌草甲素和 NVP-BEZ235联合处理后凋亡细胞比率明显减小，凋亡相关蛋白表达减少。
　　研究结论:
　　1. NVP-BEZ235单独应用可以通过G1期阻滞作用显著抑制神经母细胞瘤细胞增殖，但并不能诱导神经母细胞瘤细胞凋亡。
　　2.冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用可以有效诱导神经母细胞瘤细胞凋亡，在细胞和动物水平上对神经母细胞瘤产生显著的抗肿瘤效应。
　　3.冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用诱导神经母细胞瘤细胞凋亡是通过增强肿瘤细胞的自噬活性实现的。

目录

中英文缩写对照

绪论

第一部分NVP-BEZ235对神经母细胞瘤的抗肿瘤效应研究

引言

材料和方法

结果

讨论

第二部分冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用对神经母细胞瘤的抗肿瘤效应研究

引言

材料和方法

结果

讨论

第三部分冬凌草甲素与NVP-BEZ235联合应用诱导神经母细胞瘤凋亡的机制研究

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

附录（一）综述:NVP-BEZ235联合用药抗肿瘤的研究进展

附录（二）发表论文目录

声明