Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立及TRIM59在乳腺癌中生物学功能的研究

摘要

本研究采用In-Fusion酶系统将带有CMV启动子的8拷贝串联的转录因子CSL的结合位点的DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒载体，构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒（pLVX-8XCSL-acGFP）。在293T细胞中转染pLVX-8XCSL-acGFP质粒或对照质粒pLVX-acGFP，6小时后，再转染Notch受体的细胞内结构域（NICD）的表达质粒pETP-NICD或对照质粒pETP。转染48小时后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并且用流式细胞仪进行荧光定量分析。然后，将pLVX-8XCSL-acGFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系 LNCaP，72小时后荧光显微镜观察绿色荧光，用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强的5％及最弱的5%的细胞。提取这两部分细胞的RNA，并采用 qRT-PCR方法检测比较这两群细胞中的Notch1,Notch2以及 Notch信号通路下游靶基因 Hey1的表达水平。转染pLVX-8XCSL-acGFP的HEK-293T细胞中过表达NICD可显著增加细胞的荧光强度，定量分析显示和对照组相比荧光强度增加了约10倍。而转染pLVX-acGFP的293T细胞过表达 NICD，荧光强度则无明显改变。根据 pLVX-8XCSL-acGFP荧光强度分选出的LNCaP细胞，荧光强度高的细胞中的Notch1,Notch2和Hey1表达水平也比较高。本研究实验证明在LNCaP细胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作为报告notch信号水平的有效工具，为进一步研究 Notch信号通路对前列腺肿瘤细胞的影响打下基础。
　　本文研究了TRIM家族成员TRIM59蛋白在乳腺癌中的生物学功能，为乳腺癌的治疗提供新的靶标。我们首先通过对多个数据库进行生物信息学检索分析发现，TRIM59在乳腺癌中显著高表达。为了研究TRIM59在乳腺癌发生发展中生物学功能，我们在乳腺癌细胞系 MDA-MB-231中分别构建了TRIM59-knockdown和TRIM59-overexpression的稳定细胞系，分别通过体外的细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell实验和体内的裸鼠成瘤实验来探究 TRIM59的具体作用。结果显示TRIM59敲低后，细胞的增殖减慢，克隆形成能力减弱，细胞的迁移能力下降；反之，TRIM59过表达后，细胞的增殖能力、克隆形成能力以及细胞的迁移能力均增强。体内裸鼠皮下成瘤实验与体外实验结果一致，TRIM59敲低后裸鼠成瘤能力下降；TRIM59过表达后，裸鼠成瘤能力增强。综上所述，体内和体外结果均显示TRIM59能够促进乳腺癌的生长和转移。

目录

第一部分 Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

摘要

ABSTRACT

第一章 绪 论

1.1 Notch的研究进展

1.2 本论文的研究目的与意义

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果

3.1 构建Notch报告重组慢病毒质粒载体

3.2 在HEK293T细胞中检测pLVX-8XCSL-acGFP系统具有Notch信号特异性

3.3 Lncap-8XCSL-acGFP稳定细胞株的建立及检测

第四章 结束语

4.1 研究结论

4.2 研究展望

参 考 文 献

第二部分 TRIM59在乳腺癌中生物功能的研究

摘要

ABSTRACT

第一章 绪 论

1.1乳腺癌

1.2 TRIM家族研究进展

第三章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1实验方法

第三章 结果

3.1 Oncomine数据库分析TRIM59在乳腺癌中的表达情况

3.2建立体内、体外实验的工具细胞系

3.3 TRIM59对细胞增殖的影响

3.4 TRIM59对细胞克隆形成的影响

3.5 TRIM59对细胞迁移能力的影响

3.6 TRIM59对细胞系体内成瘤能力的影响

第四章 结束语

4.1 研究结论

4.2 研究展望

参 考 文 献

致谢

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