Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

摘要

目的 在前列腺肿瘤细胞系LNCaP中建立Notch信号报告系统.方法 采用In-Fusion酶系统将巨细胞病毒(CMV)启动子和Notch蛋白胞内结构域(ICD)细胞核内DNA结合蛋白CSL的8拷贝串联DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒载体,构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(pLVX-8XCSL-acGFP).在人胚肾293T细胞中转染pLVX-8XCSL-acGFP质粒或对照质粒pLVX-acGFP,6h后再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒pETP-NICD(过表达NICD)或对照质粒pETP.转染48 h后用荧光显微镜观察GFP的表达,用流式细胞仪进行荧光定量分析.然后将pLVX-8XCSL-acGFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系LNCaP,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光,用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强5％及最弱5％的细胞.提取这两部分细胞的RNA,采用qRT-PCR方法检测细胞中Notch1、Notch2以及Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达.结果 在转染pLVX-8XCSL-acGFP的293T细胞中,转染pETP-NICD的细胞荧光强度较转染pETP对照质粒的细胞增加了约10倍;而在转染pLVX-acGFP的293T细胞中,转染pETP-NICD的细胞与转染pETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异.根据pLVX-8XCSL-acGFP荧光强度分选出的LNCaP细胞,荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞(P均＜0.05).结论 在LNCaP细胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具.