Angiopoietin-1/Tie-2通路调控尿毒症腹透大鼠腹膜血管通透性的机制研究

摘要

目的：长期腹膜透析（腹透）后腹膜溶质转运速率增高是患者退出腹透的主要原因之一，然而其具体机制目前仍未完全阐明。血管生成素（Angiopoietin，Ang）及其受体Tie-2是参与调节血管通透性的重要通路。本研究旨在探讨Ang/Tie-2通路对腹膜血管通透性的调控作用及其可能的作用机制，为防治腹膜溶质转运速率增高和保存腹膜功能寻找新的思路。
　　方法：雄性SD大鼠（n=36）随机分为假手术组（n=12）、尿毒症组（n=12）和尿毒症腹透组（n=12）。采用5/6肾切除术构建尿毒症模型，5/6肾切除术加4.25％葡萄糖透析液腹腔灌注4周构建尿毒症腹透模型。采用HE染色、Masson染色观察大鼠腹膜形态学改变；CD31免疫组化检测腹膜血管数目；CD31/Desmin免疫荧光双染色检测腹膜血管周细胞覆盖率；2h腹膜平衡试验（2h PET）评估大鼠腹膜转运功能，并测定腹膜微血管对荧光物质FITC-BSA（69 kDa）和FITC-dextran（4 kDa）的渗漏性；Western blot检测腹膜Ang/Tie-2通路蛋白和内皮细胞间连接蛋白（VE-cadherin，Occludin）的表达。构建腺病毒载体过表达COMP-Ang-1蛋白，在尿毒症腹透大鼠模型基础上构建Ad-FLAG组（n=10）和Ad-COMP-Ang-1组（n=10），研究增强腹膜Ang-1/Tie-2信号对腹膜微血管渗漏性及腹膜功能的影响。
　　结果：⑴与假手术组相比，尿毒症非透析组大鼠腹膜结构发生明显改变，包括间皮细胞脱落，间皮下胶原纤维层增厚（177.49±42.48 vs14.01±6.12μm，P=0.027）和腹膜血管数目增多（6.43±1.13 vs2.00±0.71个/HP，P<0.001）。尿毒症腹透组大鼠腹膜上述形态结构改变则更为显著（728.68±103.47 vs177.49±42.48μm，P=0.002;18.60±1.14 vs6.43±1.13个/HP，P<0.001）。与假手术组大鼠相比，尿毒症非透析组大鼠腹膜血管周细胞覆盖率下降（0.475±0.078 vs0.890±0.059，P=0.0001），内皮细胞间连接蛋白 VE-cadherin表达量减少（0.77±0.18 vs1.28±0.27，P<0.05），Occludin表达量无明显差异（0.69±0.25 vs0.92±0.14，P>0.05），尿毒症腹透组大鼠腹膜血管周细胞覆盖率（0.121±0.056 vs0.475±0.078，P<0.0001）、内皮细胞间连接蛋白Occludin表达量（0.08±0.02 vs0.69±0.25，P=0.015）、VE-cadherin表达量（0.40±0.16 vs0.77±0.18，P=0.04）均进一步明显下降。尿毒症非透析组大鼠腹膜血管对FITC-BSA和FITC-dextran的渗漏性均较假手术组大鼠明显增高（128.88±16.51 vs2.56±0.42，P<0.0001；165.73±52.28 vs9.43±0.98，P=0.004），尿毒症腹透组大鼠腹膜血管对FITC-BSA和FITC-dextran的渗漏性则进一步增高（2151.28±151.34 vs128.88±16.51，P<0.001；5695.14±1266.02 vs165.73±52.28，P<0.001）。2h PET结果显示，与假手术组大鼠相比，尿毒症非透析组大鼠腹膜溶质转运率（D/Pcr）增高（0.65±0.13 vs0.50±0.09，P<0.05），净超滤量减少（16.10±7.25 vs22.91±4.04，P<0.05），尿毒症腹透组大鼠腹膜溶质转运增高（0.92±0.06 vs0.65±0.13，P<0.05）和净超滤减少（10.43±1.08 vs16.10±7.25，P<0.05）更为明显。⑵尿毒症非透析组大鼠较假手术组大鼠，腹膜Ang-1蛋白表达（0.91±0.14 vs1.50±0.90，P=0.031）及Tie-2磷酸化水平（0.22±0.04 vs0.33±0.09，P<0.05）明显下调，Ang-2蛋白表达无明显差异（0.52±0.05 vs0.40±0.12，P>0.05），腹透4周后，腹膜Ang-1蛋白表达（0.59±0.02 vs0.91±0.14，P=0.032）及Tie-2磷酸化水平（0.16±0.03 vs0.33±0.09，P<0.05）进一步明显下调，Ang-2表达明显增加（0.58±0.09 vs0.40±0.12，P<0.05）。⑶采用腺病毒载体增强Ang-1/Tie-2信号，Ad-COMP-Ang-1组大鼠与尿毒症腹透组和Ad-FLAG组相比，其腹膜血管周细胞覆盖率明显增加（0.656±0.078 vs0.121±0.056；0.656±0.078 vs0.170±0.067，P均<0.0001），内皮细胞间连接蛋白Occludin表达（0.55±0.06 vs0.16±0.06,0.55±0.06 vs0.25±0.05，P均<0.001）、VE-cadherin表达（1.13±0.03 vs0.72±0.16,1.13±0.03 vs0.97±0.21，P均<0.05）均明显上调，腹膜微血管对 FITC-BSA和 FITC-dextran的渗漏性明显下降（FITC-BSA：227.371±16.703 vs2151.283±151.338,227.371±16.703 vs2151.283±151.338，P均<0.001）；（FITC-dextran：695.419±107.166 vs5695.136±1266.021，695.419±107.166 vs5746.325±165.676，P均<0.001）。2h PET结果显示，与尿毒症腹透组和病毒对照组相比，Ad-COMP-Ang-1组大鼠腹膜溶质转运率（D/Pcr）有所降低（0.58±0.10 vs0.92±0.06；0.58±0.10 vs0.93±0.06，P均<0.05）。⑷与假手术组和尿毒症非透析组相比，尿毒症腹透组大鼠腹膜血管内皮细胞内PI3K和AKT磷酸化水平均明显下降（0.460±0.038 vs0.605±0.081，P=0.04；0.419±0.106 vs0.752±0.037，P=0.01），采用载有Ad-COMP-Ang-1的腺病毒增加腹膜Ang-1/Tie-2通路活性后，腹膜血管内皮细胞内PI3K和AKT磷酸化水平均有明显上调（1.219±0.063 vs0.419±0.106，P<0.0001；2.155±0.103 vs0.419±0.106，P=0.0001）。
　　结论：①尿毒症和非生物相容性腹透液可导致腹膜周细胞覆盖率降低，血管内皮间连接蛋白表达下调，腹膜血管渗漏性增高，溶质转运增高，净超滤量减少。②尿毒症和非生物相容性腹透液可下调腹膜Ang-1/Tie-2蛋白表达。③增强腹膜Ang-1/Tie-2通路活性后，腹膜血管周细胞覆盖率和内皮间连接蛋白表达量均有所增加，腹膜血管渗漏性和溶质转运速率下降。4.Ang-1/Tie-2通路对腹膜血管通透性的调控可能是通过内皮细胞内PI3K/AKT信号通路介导。

目录

英文缩略词表

绪论

第一部分 尿毒症和腹透对腹膜形态结构、血管内皮细胞间连接蛋白表达、血管通透性及转运功能的影响

前言

第一节 尿毒症腹透大鼠模型的构建

第二节 尿毒症和腹透对大鼠腹膜形态结构的影响

第三节 尿毒症和腹透对大鼠腹膜血管周细胞覆盖率的影响

第四节 尿毒症和腹透对腹膜血管内皮细胞间连接蛋白表达的影响

第五节 尿毒症和腹透对大鼠腹膜血管渗漏性的影响

第六节 尿毒症和腹透对大鼠腹膜溶质转运的影响

第七节 腹膜周细胞覆盖率、血管内皮间连接蛋白表达与腹膜血管通透性和转运功能的关系

讨论

第二部分 Angiopoietin/Tie-2在尿毒症和腹透大鼠腹膜中的表达及与血管渗漏性的关系

前言

第一节 Ang/Tie-2在尿毒症和腹透动物腹膜上的表达

第二节 腹膜Ang-1蛋白表达与血管渗漏性的关系

讨论

第三部分 过表达COMP-Ang-1蛋白对尿毒症腹透大鼠腹膜血管渗漏性的影响

前言

第一节 Ad-COMP-Ang-1在体内实验的验证

第二节 过表达COMP-Ang-1蛋白对尿毒症腹透大鼠腹膜形态结构的影响

第三节 过表达COMP-Ang-1蛋白对尿毒症腹透大鼠腹膜周细胞覆盖率的影响

第四节 过表达Ang-1蛋白对尿毒症腹透大鼠腹膜内皮间连接蛋白表达的影响

第五节 过表达腹膜Ang-1蛋白对尿毒症腹透大鼠腹膜血管渗漏性的影响

第六节 过表达腹膜Ang-1蛋白对尿毒症腹透大鼠腹膜转运功能的影响

讨论

第四部分 Ang-1/Tie-2通路抑制尿毒症腹透大鼠腹膜血管通透性增高的可能胞内机制

前言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

致谢

在读期间学术论文和科研成果

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