结肠癌相关生物标记物的验证及功能研究

摘要

目的：课题组前期工作建立结肠癌转录组数据库，筛选肿瘤相关基因。SCRN1和BRG1为数据库筛选出的结肠癌相关基因。本研究探索SCRN1和BRG1在结肠癌进展中的作用及其机制。
　　方法：
　　1．应用RNA干扰技术下调结肠癌细胞株RKO和HCT116中SCRN1表达。在干扰前后的细胞株中，MTT细胞增殖实验和平板克隆形成实验检测肿瘤细胞增殖能力；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力；ELISA实验检测细胞培养液中MMP-2和MMP-9含量。
　　2．Real-time PCR和Western blot检测结肠癌和正常结肠组织中BRG1 mRNA和蛋白表达差异（n=40）；结肠癌组织芯片（n=191）结合免疫组化技术检测结肠癌样本中 BRG1蛋白表达情况，并分析其与临床病理参数及患者预后的关系。构建BRG1表达稳定下调的结肠癌细胞株，体内体外实验研究 BRG1表达下调对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响。
　　结果：
　　1．结肠癌细胞中 SCNR1表达下调后，细胞增殖能力显著降低（RKO，P<0.001;HCT116，P<0.001）；克隆形成显著减少（RKO，P<0.01;HCT116，P<0.01）；Transwell实验中穿膜细胞数目显著减少（RKO，P<0.01; HCT116，P<0.01）；细胞培养液中MMP-2含量（RKO，P<0.001;HCT116，P=0.005）和 MMP-9含量（RKO，P=0.001;HCT116，P=0.037）显著降低。
　　2．40例配对的结肠癌和正常癌旁组织中，36例结肠癌组织中的BRG1 mRNA表达水平较其配对的正常粘膜组织增高，占总数的90%。免疫组织化学染色显示BRG1主要在肿瘤细胞核内表达，阳性表达的细胞呈棕黄色。BRG1表达增高与结肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位无显著关联（P>0.05）；而与结肠癌患者的肿瘤浸润深度（P<0.004）、淋巴结转移（P=0.001）、远处转移（P<0.001）、AJCC分期（P<0.001）、分化程度（P=0.017）、脉管侵犯（P=0.042）显著相关。BRG1表达呈中等强度阳性及强阳性的患者术后总生存期较短（P<0.001），且更易复发（P=0.001）。BRG1表达下调后，结肠癌细胞增殖活性显著减弱（DLD1，P<0.001;HCT116，P<0.001）；克隆形成显著减少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）;Transwell实验中穿膜细胞数目显著减少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）。BRG1表达下调后，DLD1细胞株在裸鼠皮下形成的肿瘤重量较阴性对照组显著减小（P<0.01）。结论：SCRN1和BRG1参与结肠癌进展，为潜在的肿瘤标志物和治疗靶点。
　　第二部分 BRG1在结肠癌中的表达及其生物学功能研究
　　目的：课题组前期工作建立结肠癌转录组数据库，发现BRG1为结肠癌相关基因，本研究探究BRG1在结肠癌患者中的临床意义，及其在结肠癌细胞中的生物学功能。
　　方法：Real-time PCR检测40对结肠癌组织和配对的正常结肠粘膜中BRG1 mRNA表达水平，并通过Western blot验证BRG1的蛋白表达水平，通过免疫组化技术检测组织芯片中191例结肠癌样本BRG1表达的情况。统计学分析BRG1表达同患者临床病理信息的相关性，利用Kaplan-Meier和Cox比例风险模型分析结肠癌中BRG1表达差异同患者术后生存情况的关联。通过慢病毒干扰，构建BRG1表达稳定下调的结肠癌细胞株，体内体外实验探究 BRG1表达对结肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。
　　结果：
　　1．Real-time PCR结果显示：36对样本出现BRG1表达增高，占90%（36/40），其中有26例增高达2倍以上，占65%（26/40）；Western blot结果显示，在大部分结肠癌组织中BRG1蛋白水平高于对应的正常结肠粘膜组织。
　　2．免疫组化结果显示：BRG1主要在肿瘤细胞核内表达，阳性表达细胞呈棕黄色。191例结肠癌组织中，多数BRG1表达高于其对应的正常粘膜组织；且差异具有统计学意义。BRG1表达增高同结肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位无明显关联（P>0.05），但与肿瘤浸润程度（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.001）、远处转移（P<0.001）、AJCC分期（P<0.001）、分化程度（P=0.017）及脉管侵犯（P=0.042）显著相关。
　　3．Kaplan-Meier生存分析结果显示BRG1高表达的患者术后总生存期及无瘤生存期较BRG1低表达的患者显著缩短（P<0.001，P=0.001）；Cox比例风险模型提示BRG1表达与结肠癌患者预后有关，但不是独立影响因素。
　　4．构建针对 BRG1的慢病毒干扰载体，下调结肠癌细胞中 BRG1的表达，Real-time PCR及Western blot验证BRG1基因的敲减效率达70%以上。
　　5．在 BRG1表达下调后，CCK-8增殖实验提示结肠癌细胞的增殖能力受到抑制（DLD1，P<0.001;HCT116，P<0.001）；平板克隆形成显示结肠癌细胞的克隆形成数目较对照组显著减少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）；Transwell小室迁移及侵袭实验均显示穿过膜的结肠癌细胞数减少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）。裸鼠成瘤实验显示：BRG1基因表达下调的结肠癌细胞在裸鼠皮下形成的移植瘤重量明显小于对照组（P<0.01）。
　　结论：BRG1促进结肠癌进展，为潜在的肿瘤标志物和治疗靶点。

目录

中英文名词对照

第一部分 SCRN1在结肠癌细胞中的生物学功能研究

摘要

前言

第一节 构建SCRN1表达下调的结肠癌细胞模型

1材料与方法

2结果

第二节 SCRN1在结肠癌细胞中的功能学研究

1 材料与方法

2 结果

讨论

参考文献

第二部分 BRG1在结肠癌中的表达及其生物学功能研究

摘要

前言

第一节 BRG1在结肠癌组织中的表达情况

1材料与方法

2结果

第二节 构建BRG1表达下调的结肠癌细胞模型

1材料与方法

2结果

第三节 BRG1在结肠癌细胞中的功能学研究

1材料与方法

2结果

讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位论文期间发表的学术论文