上海地区不同来源金黄色葡萄球菌分子分型及毒力多样性

摘要

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是一种重要的临床致病菌，能够引起许多严重疾病的发生。金葡菌还可以通过污染食物引起人群食物中毒，严重者可以导致死亡。研究表明，金葡菌的许多毒力因子编码基因定位于可移动基因元件上，能够通过基因水平转移在不同菌株之间传播，进而影响菌株致病能力。不同来源的金葡菌菌株可能由于特定毒力因子分布不同，其致病能力存在显著差异。因此探究不同来源的金葡菌菌株遗传背景差异以及毒力因子编码基因的分布规律，对于了解致病性金葡菌菌株的传播途径，追踪其污染源，预防控制金葡菌相关感染疾病的发生具有重要意义。本论文主要研究内容和结果如下：
　　1.调查上海地区市售食品中金葡菌的污染情况以及MRSA流行规律。分别从上海市多个奶牛场、农贸市场以及超市采集607份不同食品样品，然后按照GB4789.10-2010并结合PCR分子鉴定方法进行金葡菌的分离鉴定。结果表明，共有117份（19.3%）食品样品受到金葡菌污染，其中鲜肉样品中金葡菌的污染率最高（28.1%），其次是速冻米面制品（21.3%）和生牛乳（20.2%），而新鲜果蔬（11.8%）和加工豆制品（8.8%）中金葡菌污染率相对较低。在117份金葡菌污染样品中共分离获得142株不同金葡菌菌株，然后采用头孢西丁药敏纸片法和mecA基因PCR检测法，筛查食源性MRSA菌株。结果表明，8株菌（5.6%）被鉴定为MRSA，其中7株菌分离自牛奶样品，1株菌来自于速冻米面制品。
　　2.利用多位点序列分型（MLST）、蛋白A基因分型（spa typing）以及agr基因分型方法，对上海地区不同食品中污染的142株金葡菌菌株进行群体遗传多样性研究。结果表明，在142株食源性金葡菌菌株中共鉴定出26种序列型（ST），16种克隆复合体（CC），34种蛋白A基因型（spa types）以及6种agr等位基因型，其中发现4个新的ST型（ST2632-ST2635），4个新的spa types（t10761，t10777，t10793和 t10798）以及1个新的agrΙ型变异体。本研究结果发现CC188-t189-agrΙ（28.2%）是上海地区食品中污染金葡菌的最流行菌株遗传型，spa分型方法比 MLST分型方法具有更强的分辨能力，同一个克隆世系的金葡菌菌株具有一致的agr等位基因型。
　　3.25种毒素编码基因在142株食源性金葡菌菌株中的分布规律表明，103株（72.5%）食源性菌株都至少携带有一种毒素编码基因。其中，肠毒素基因 sep（43.7%）的携带率最高，其次是肠毒素基因 sej（26.1%）和杀白细胞毒素编码基因pvl（21.1%）。来自于肉制品（80%）和奶制品（89.7%）的金葡菌菌株，携带毒素编码基因的比例明显高于其它食品来源的金葡菌菌株，表明肉制品以及乳制品中污染的金葡菌菌株对人群具有较高的潜在威胁。在103株毒素编码基因阳性的食源性菌株中共发现52种不同毒素基因型，同一个克隆世系的金葡菌菌株可以携带有不同的毒素基因型。本研究没有发现毒素基因型与菌株遗传型之间存在明显相关性，但是不同菌株遗传型携带的毒素编码基因数目具有明显差异，如克隆世系 CC5，CC9，CC20，CC50和 CC72平均携带至少5个毒素编码基因。
　　4.肠毒素基因簇（enterotoxin gene cluster，egc）被推测可能促进金葡菌在人体中的定殖生存能力，而金葡菌感染通常由人体共生菌株引起的，因此评价 egc阳性菌株群体的毒力特征十分必要。本研究比较评价了医源性和食源性金葡菌菌株群体中携带egc locus的多样性。结果表明，在226株不同来源金葡菌分离株中共检出43株（16.17%） egc阳性菌株，统计学分析表明egc在医源性（18.55%，23/124）和食源性（14.08%，20/142）金葡菌菌株分中的检出比例无显著性差异。本研究共发现7种不同egc locus基因型，其中egc1型（seg，sei，sem，sen和seo）占39.53%，egc2型（seg，sei，sem，sen，seo和selu）占48.54%，其余5种egc基因型缺失一种或者多种肠毒素编码基因。
　　5.采用特异PCR检测了30种毒素编码基因以及20种黏附相关基因在egc阳性菌株群体中的分布规律。结果表明，26种毒素编码基因在43株egc阳性菌株中都能检出，其中杀白细胞毒素编码基因pvl在egc阳性菌株中分布最广（76.7%）。此外，43株egc阳性菌株全部携带有4种溶血素编码基因（hla，hlb，hld和hlg2）。统计分析结果表明，只有毒素休克综合症毒素编码基因 tsst-1在医源性和食源性菌株中的分布具有明显差异。黏附相关基因检测结果表明，除fnbB（18.6%）外，其余黏附相关基因在 egc阳性菌株中都有很高的分布率（76.7-100%）。总之，毒力编码基因的高携带率表明了金葡菌egc阳性菌株对人群公共健康具有重要潜在威胁。
　　6.采用MLST、MLVA和 PFGE三种分型方法，系统评价了43株不同来源的金葡菌 egc阳性菌株的遗传多样性，结果鉴定出17种STs，29种MLVA型以及28种PFGE型。其中CC5-agrII是egc阳性菌株中最流行克隆世系（48.84%）。本研究结果表明 MLVA分型与MLST分型具有较强的相关性，MLVA分型比PFGE和MLST分型具有更强的分辩能力。43株 egc阳性菌株共携带有33个毒素基因型和13种黏附基因型，其中26个毒素基因型特异存在于某一个菌株，而属于同一克隆世系的菌株都具有特定的黏附基因型。
　　7.采用Caco-2细胞体外培养，以及庆大霉素结合溶葡萄球菌酶保护试验，探究了金葡菌12个不同克隆世系菌株对Caco-2细胞的侵袭能力。结果表明，CC5，CC9，CC25，CC30，CC50，CC59，CC239和CC398等克隆世系都存在Caco-2细胞强侵袭株，而克隆世系CC1，CC20，CC72和CC121则没有发现强侵袭株。值得关注的是，与动物特异相关克隆世系MRSA-CC9存在Caco-2细胞强侵袭株，表明动物源MRSA-CC9具有重要的人群潜在致病能力。此外本研究发现金葡菌菌株的菌膜形成能力与侵袭能力表现出较强的一致性，且泊松相关分析表明金葡菌菌膜形成能力与细胞侵袭力呈正相关（R=0.743）。

目录

声明

符号说明

第一章 文献综述

1.1 金黄色葡萄球菌基本生物学特点

1.2 金葡菌流行病学

1.3金葡菌人体定殖和侵袭

1.4金葡菌毒素因子

1.5毒力基因水平转移

1.6金葡菌常用基因分型方法

1.7动物源金葡菌的进化传播

1.8研究目的及意义

第二章 上海市售食品中金葡菌基因分型与毒素基因分布规律

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第三章 不同来源金葡菌肠毒素基因簇阳性菌株分子分型及毒力特征分析

3.1前言

3.2实验材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章 不同基因型金葡菌菌株Caco-2细胞侵袭力差异分析

4.1前言

4.2实验材料与方法

4.3结果分析

4.4讨论

第五章 主要结论与创新性

5.1主要结论

5.2特色与创新

5.3展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间已经发表和准备中的学术论文