Snail诱导EMT过程中改变的miR-494和溶酶体在乳腺癌发生发展和转移中的功能及其分子机制

摘要

EMT的概念最早是在发育研究的过程中被提出来的，用来描述胚胎上皮细胞向间充质细胞转化的过程。近期的研究发现 EMT的过程在肿瘤中同样存在。EMT被认为是肿瘤转移的起始步骤，这个过程伴随着细胞连接打断，极性消失，细胞外基质被降解，骨架改变，从而使得细胞运动能力增强，干性增强。Snail是诱导和维持EMT的一个重要的转录因子。越来越多的基础和临床研究发现，Snail对肿瘤的生长和转移至关重要，分析和研究Snail如何在肿瘤生长和转移中发挥关键性的作用，有助于我们更好的解析肿瘤行为学。
　　第一部分的研究内容是我们在MCF-10A细胞中稳定表达Snail的突变形式Snail-6SA建立了一组细胞EMT模型，MCF-10A-NC/MCF-10A-6SA，通过对这两组细胞进行microRNA芯片表达谱分析，发现miR-494在MCF-10A-6SA细胞中表达显著降低。然后，我们在乳腺癌细胞系中检测miR-494的表达，发现与MCF-10A这株正常的乳腺上皮细胞相比，各个乳腺癌细胞系中miR-494的表达显著降低。与此同时，我们还检测了24例临床乳腺癌病人标本中miR-494的表达，发现miR-494在人乳腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。为了进一步分析miR-494在乳腺癌中表达和分布情况，我们采用RNA原位杂交的方法，在含有50对乳腺癌和癌旁组织的样本芯片上，检测miR-494的表达情况，发现miR-494表达于乳腺的导管组织中，包括各种大小的导管，并且与癌旁组织相比，癌组织中miR-494的表达显著降低。然后我们对miR-494进行了体内外功能的检测，发现过表达miR-494可以抑制乳腺癌的发生发展和转移。对其潜在靶基因进行生物信息学预测，并通过荧光素酶报告基因实验证实，PAK1是miR-494的直接靶基因，之后通过loss-of-function和gain-of-function实验证明PAK1是miR-494的功能性靶基因。在组织芯片上，运用免疫组化的方法分析50对乳腺癌病人组织中PAK1的表达情况，发现与癌旁组织相比，癌组织中PAK1的表达显著升高，并且PAK1的表达与miR-494的表达呈线性负相关。此外，体外过转PAK1，可以显著逆转miR-494对乳腺癌细胞系的增殖，克隆以及迁移侵袭能力的抑制作用。我们的研究发现miR-494在调控乳腺癌的发生发展以及转移中发挥了重要的作用，也为将来miR-494成为临床药物应用治疗肿瘤提供了一定的展望。
　　第二部分研究中，在Snail诱导MCF-10A细胞发生EMT的过程中，发现GAPDH的表达发生了很明显上调，通过检测mRNA和蛋白，发现GAPDH的表达上调主要发生在蛋白水平，于是我们从蛋白降解水平寻索，发现降解GAPDH蛋白的最终场所溶酶体发生了很明显的变化，而且无论外源性过表达的Snail还是内源累积的Snail都能显著抑制溶酶体的合成，并且从分子机制上发现Snail可以在转录水平直接抑制转录因子EB(TFEB)的表达来抑制溶酶体的合成。

目录

声明

第一章 绪论

1.研究背景

第二章 miR-494在乳腺癌发生发展和转移中的功能及其分子机制

1.材料和方法

2.实验结果

3.讨论

第三章 Snail调控溶酶体合成在乳腺癌发生发展和转移中的功能及分子机制

1. 材料与方法

2. 实验结果

第三节： 讨论

第四章 总结与展望

1.内容总结

2.创新性

3. 不足和未解决的问题

4.展望

参考文献

附录：博士期间已发表和待发表的论文

致谢