团头鲂(Mfegalobrama amblycephala)促性腺激素β亚基基因5’端启动子区初步研究以及外源性雌二醇、皮质醇对β亚基基因表达的影响

摘要

为了研究团头鲂(Megalobrama amblycephala)促性腺激素(Gonadotropin hormone，GtH)β亚基转录水平的调控机制，本论文首先运用PCR-末端加尾法克隆了团头鲂GtH Iβ亚基基因5’端侧翼序列，并对序列进行生物信息学分析，得到一系列可能对GtH Iβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点，根据位点信息设计并构建了一系列荧光素酶缺失表达载体。然后依据相同的方法克隆了GtHⅡβ亚基基因5’端侧翼序列，对序列进行分析后，同样建立了一系列缺失表达载体。以上实验为今后进一步研究转录因子对GtHβ亚基转录调控的作用机制打下了基础。最后，根据本实验室已经得到的团头鲂GtH Iβ和GtHⅡβ亚基cDNA序列信息，运用SYBR Green I荧光定量PCR的方法检测了外源性雌二醇(estradiol-17β，E2)，皮质醇(Cortisol)对团头鲂GtH Iβ和GtHⅡβ亚基基因表达的影响。本论文的完成，填补了对团头鲂GtH Iβ和GtHⅡβ亚基基因侧翼序列研究的空白，为基因重组型团头鲂“全鱼”促性腺激素及其类似物的研究奠定了理论基础。
　　 1.团头鲂GtHⅠβ亚基基因5’端侧翼序列克隆及其表达载体的构建首先运用PCR-末端加尾法克隆了团头鲂GtH Iβ亚基基因5’端侧翼序列；然后利用生物信息学相关软件对该序列进行了序列分析；最后在序列分析结果的基础上，构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示：克隆所得到的团头鲂GtH Iβ亚基基因5’端侧翼序列长度为479bp，其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptx1等可能对GtH Iβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法扩增得到了全长-479+20bp以及-365+20bp、-230+20bp、-150～+20bp的缺失片段，并将其连接至pGL3-Basic报告基因载体，成功构建了团头鲂GtH Iβ亚基基因5’端侧翼序列的表达载体，为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。
　　 2.团头鲂GtHⅡβ亚基基因5’端侧翼序列克隆及其表达载体的构建运用与第1部分研究相同的方法克隆得到了团头鲂GtHⅡβ亚基基因5’端侧翼序列，利用生物信息学相关软件对该序列进行了序列分析；最后在序列分析结果的基础上，构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示：克隆所得到的团头鲂GtHⅡβ亚基基因5’端侧翼序列长度为1354bp，其中包括TA盒、ERE、ARE、PRE、GRE、LHX3、SF-1、Sp1、Pit-1、NF-Y和AP1等可能对GtHⅡβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法扩增得到了全长-1354～+40bp以及-771～+40bp、-561～+40bp、-346～+40bp、-199～+40bp、-58～+40bp的缺失片段，并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体，成功构建了团头鲂GtHⅡβ亚基基因5’端侧翼序列的表达载体，为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。，并将其连接至pGL3-Basic报告基因载体，成功构建了团头鲂GtHⅡβ亚基基因5’端侧翼序列的表达载体，为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。
　　 3.外源性雌二醇，皮质醇对团头鲂GtHβ亚基基因表达的影响运用SYBR Green I荧光定量PCR方法分析了外源性皮质醇和雌二醇对团头鲂GtHβ亚基基因表达的影响。实验设计为8周，实验组每两周分别注射一次0.2mg/kg体重的皮质醇以及0.5mg/kg体重的雌二醇(均用57％酒精溶解)，对照组注射同剂量的57%酒精，同时设置了空白实验组。实验期间没有投喂饲料。在本实验条件下，研究结果显示：注射2次与注射4次雌二醇对团头鲂GtH Iβ和GtHⅡβ亚基基因表达均无显著影响。注射2次和4次皮质醇后，GtH Iβ亚基的表达未出现明显变化；而注射2次皮质醇对GtHⅡβ亚基的表达没有影响，但注射4次皮质醇后，GtHⅡβ亚基的表达量降低，且与对照组相比差异极显著(P＜0.01)；另外，对照组与空白实验组相比，GtH Iβ和GtHⅡβ亚基基因的表达量无显著差异，表明实验操作并未对团头鲂GtHβ亚基基因表达造成显著的影响。