海洋微生物N2a过氧化氢酶性质、保存稳定性及固定化的研究

摘要

过氧化氢酶是一种能够高效催化分解过氧化氢的酶，广泛应用于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。本论文对海洋微生物N2a过氧化氢酶酶学性质、保存稳定性、应用潜力以及固定化等方面进行了研究。 对该新型海洋微生物N2a过氧化氢酶进行初步纯化，并对N2a过氧化氢酶的基本酶学性质进行研究，结果表明：过氧化氢酶最适作用温度为30℃，pH在6-11时，过氧化氢酶的活性没有显著变化，有较宽且偏碱的最适pH范围；不同温度恒温水浴处理2h后，30℃下过氧化氢酶活保留率在90％以上，而60℃时活性仅为初始酶活的6.8％；在不同pU的缓冲体系里于4℃下放置48 h后，在pH6-8范围内酶活性较稳定，该酶在碱性条件下相比在酸性条件下更稳定；Mn2+对酶有较好的激活作用；Ca2+、Mg2+、K+、NH4+对酶无影响；Zn2+、Li+、Sr2+、Ba2+、Ag+对酶有抑制作用；微生物过氧化氢酶与大部分非金属离子配伍性良好；NaCl浓度为0-1.0mol/L时，对过氧化氢酶的活性没有显著影响，NaCl浓度为1.0-2.0mol/L时，酶活力逐渐下降，NaCl浓度≥3.0mol/L时，过氧化氢酶失活。 过氧化氢酶较不稳定，在存放过程中酶的活力损失较大。加入明胶、氯化钙、甘油、氯化钠以及戊二醛等不同稳定剂后，酶活保留率都有明显的提高，其中盐析后置于Tris缓冲液中的酶液加甘油稳定性最好。向其中加入甘油90g/L，在30℃保存60 d酶活保留率为70.3％。 将N2a所产的过氧化氢酶同来源于牛肝的过氧化氢酶进行了热(60℃、70℃)、碱(9.0、10.0、11.0)稳定性的比较。结果显示，N2a所产的过氧化氢酶对高温和强碱性的耐受性明显优于牛肝过氧化氢酶，在纺织染整工艺中具有良好的应用潜力。 以海藻酸钠为载体采用包埋法制备固定化过氧化氢酶，对其最佳固定化条件与酶学性质进行了研究。结果表明：海藻酸钠浓度2％，氯化钙浓度3％，给酶量40 ml，固定化时间45 min，在此条件下制备的固定化过氧化氢酶活性保持率为37.2％。该酶经固定化以后，酶学性质研究表明，热稳定性提高，固定化酶在60℃保存2 h相对活力为初始的27.3％，而游离酶仅为6.8％，且其pH稳定性及贮存稳定性较游离酶均有所增强，固定化过氧化氢酶还具有良好的可操作性，重复8次，酶活力仍能保持在75％以上。 本结果具有一定的创新性，填补了国内在海洋微生物过氧化氢酶研究领域的一些空白，对加速开发我国海洋微生物资源的利用及其产业化具有重要的理论和实际意义。

目录

文摘

英文文摘

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引言

第一章文献综述

1.1 过氧化氢酶的研究概况

1.1.1 过氧化氢酶的类型划分

1.1.2 过氧化氢酶的结构特点和功能

1.1.3 过氧化氢酶的生理功能和环境胁迫的关系

1.1.4 过氧化氢酶的应用

1.1.5 国内外过氧化氢酶研究现状

1.2 固定化酶的研究概况

1.2.1 固定化酶的概述

1.2.2 固定化酶的方法

1.2.3 固定化酶的性质

1.2.4 固定化酶在食品工业上的应用

1.2.5 固定化酶的发展方向

1.3 本论文研究的实践意义和内容

第二章海洋微生物过氧化氢酶酶学性质的研究

2.1 材料与方法

2.1.1 菌株及培养基

2.1.2 试剂及仪器

2.1.3 主要试剂的配制

2.1.4 过氧化氢酶活性的测定

2.1.5 蛋白质含量的测定

2.1.6 菌株N2a过氧化氢酶的初步纯化

2.1.7 菌株N2a过氧化氢酶酶学性质的研究

2.2 结果与讨论

2.2.1 标准蛋白曲线的制定

2.2.2 菌株N2a过氧化氢酶的初步纯化

2.2.3 菌株N2a过氧化氢酶酶学性质的研究

2.3 本章小结

第三章过氧化氢酶的保存稳定性及其应用潜力的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 主要试剂

3.1.2 主要仪器

3.1.3 过氧化氢酶活性的测定

3.1.4 发酵过氧化氢粗酶液的制备

3.1.5 过氧化氢酶的保存实验

3.2 结果与讨论

3.2.1 酶液存放稳定性的研究

3.2.2 不同稳定剂对过氧化氢酶在30℃保存稳定性的影响

3.2.3 过氧化氢酶粗酶液应用潜力的研究

3.3 本章小结

第四章海洋微生物过氧化氢酶固定化的研究

4.1 材料与方法

4.1.1 主要试剂

4.1.2 主要仪器

4.1.3 游离酶的活性测定

4.1.4 固定化酶的活性测定

4.1.5 固定化过氧化氢酶的制备方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 固定化过氧化氢酶的制备

4.2.2 制备条件对过氧化氢酶固定化的影响

4.2.3 固定化酶的酶学性质

4.3 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢