鳜消化系统器官发生的组织学及胃蛋白酶原基因的克隆

摘要

利用形态学观察和连续组织切片技术，对出膜后0～35d的鳜(Siniperca chuatsi)仔稚鱼消化系统胚后发育的组织学特征进行了系统研究。结果表明，试验水温为18.0-20.0°C时，鳜初孵仔鱼消化道仅为一段位于脊索下方、卵黄囊上方的实心细胞索，卵黄囊呈椭圆形，含有油球。孵化后第2天，口和肛门形成，消化道贯通。孵化后第4天，消化道上皮细胞出现分化，肝脏和胰脏出现，仔鱼开始由内源性营养向外源性营养转变。孵化后第5天，仔鱼开口摄食，消化道分化成口咽腔、食道、胃、前肠和后肠。孵化后第9天，卵黄囊完全被吸收。此后随着鱼体的生长，消化系统从结构和功能上逐步地发育完善和成熟。孵化后第7天前肠中出现空泡，孵化后第8天仔鱼后肠中发现有嗜曙红颗粒，表明肠上皮细胞吸收了脂肪和蛋白质。在孵化后第13天，出现胃腺，标志着稚鱼期的开始。 胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，是胃里具有消化功能的蛋白酶原，属于天冬氨酸蛋白酶家族。脊椎动物胃蛋白酶原一般在胃粘膜中合成，在酸性条件下转变成有活性的胃蛋白酶。鳜为典型的肉食性鱼类，自开食起终生以活鱼虾为食，为了解鳜胃蛋白酶原基因的分子特征，利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长序列，并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。结果表明，鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367bp，5’端非翻译区43 bp，3’端非翻译区187 bp，开放阅读框(ORF)1137 bp，共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为42.9％～87.3％，表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的NJ系统进化树表明：除了美洲红点鲑和斜带石斑鱼的C型胃蛋白酶原属C型外，其他鱼类的胃蛋白酶原单独聚为一支，其中鳜胃蛋白酶原与美洲黄盖碟胃蛋白酶原AIIa的亲缘关系最近，推测本研究获得的胃蛋白酶原为A型。RT-PCR检测结果表明胃蛋白酶原A基因在食道、胃、幽门盲囊、肝胰脏、前肠、脾、肾、心、皮肤、肌肉和卵巢中均有表达。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础，而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。

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引言

第一章鳜消化系统器官发生的组织学

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1仔稚鱼的生长及消化系统形态学特征

2.2 口咽腔

2.3食道

2.4胃

2.5肠和幽门盲囊

2.6肝脏和胰脏

3讨论

3.1鳜消化系统的早期发育

3.2胃腺和幽门盲囊

3.3嗜曙红颗粒、空泡和杯状细胞

第二章鳜胃蛋白酶原基因的克隆

1材料与试剂

1.1材料

1.2质粒与菌株

1.3 工具酶及分子量标准

1.4试剂盒

1.5主要试剂

1.6实验仪器

2实验方法

2.1鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆

2.2鳜胃蛋白酶原基因序列的克隆

2.3生物信息学分析

3结果

3.1鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆

3.2鳜胃蛋白酶原基因序列的克隆

3.3序列分析

3.4鳜胃蛋白酶原基因组织表达的RT-PCR检测

4讨论

4.1鳜胃蛋白酶原基因的分子特征

4.2不同组织的基因表达特征

小结

参考文献

发表论文

致谢