中国沿海5个地理群体长蛸的遗传多样性研究

摘要

长蛸（Octopus variabilis，Sasaki1929）隶属于头足纲（Cephalopoda）、八腕目（Octopoda）、蛸科（Octopodidae）、蛸属（Octopus），在我国南北沿海的渤海、黄海、东海、南海和朝鲜西海岸以及西太平洋的日本列岛海域。长蛸蛋白质丰富，含脂率高，长蛸不仅有很高的食用价值，也有相当的药用价值，是一种重要的经济头足类。目前，在沿海地区已逐渐开展了长蛸的人工养殖。本文主要对分布于中国沿海的5个地理群体长蛸的遗传分化、群体遗传多样性以及不同群体之间的遗传分化及亲缘关系进行了研究，以期为长蛸的种质资源保护、群体演化关系的分析、品种的选育以及开发利用提供理论依据。 对我国沿海5个自然群体长蛸的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COI）部分序列进行了测定和分析，经比对获得658bp核苷酸片段，其中碱基T、C、A和G的平均含量分别为37．02％、18．46％、30．15％和14．35％，AT的含量明显高于GC的含量。5个自然群体的长蛸中共发现18个变异位点，得到15个单倍型，包括4个共享单倍型，其中青岛群体的核苷酸差异数K以及平均核苷酸多样性指数Pi最高，烟台群体最低；群体间，青岛群体在群体间核苷酸差异数K、群体间平均每位点核苷酸替代数Dxy和群体间每位点净核苷酸替代数Da三个指标上都表现出比其它群体之间较高的水平，说明青岛群体具有最为丰富的遗传多样性。MEGA3．1软件计算5个群体间的Kimura2-paramter遗传距离，大连群体和青岛群体之间的遗传距离最远为0．0077，而大连群体与烟台群体之间的遗传距离最低，为0．0029。AMOVA分析表明，五群体间总遗传分化系数Fst=0．17410（P<0．05），群体间遗传分化远小于群体内。NJ法和UPGMA法构建的分子进化树，5个地理群体的长蛸聚为两个族群，大连、烟台群体聚为一族群，青岛、连云港和舟山群体聚为另一族群。 对长蛸（O．variabilis）和小孔蛸（Cistopus indicus Gray）的线粒体DNA16S rRNA和COI基因片段进行了研究。经PCR扩增和序列测定，分别得到16S rRNA和COI2个基因片段的碱基序列，其中长蛸16S rRNA基因片段的大小为554bp，碱基A，T，G，C的含量分别为38．1％，35．6％，8．3％和18．1％； COI基因片段的大小为658bp，碱基A，T，G，C的含量分别为36．9％，30．2％，18．5％和14．3％。小孔蛸16S rRNA基因片段的大小为514bp，碱基A，T，G，C的含量分别为37．5％，35．0％，9．1％和18．3％； COI基因片段的大小为665bp，碱基A，T，G，C的含量分别为30．1％，35．2％，14．4％和20．3％．两种动物的2种基因片段中，AT含量均明显高于GC含量，这与虾蟹类等无脊椎动物的16S rRNA和COI基因片段研究结果相似。长蛸和小孔蛸种内变异都较低，而两者间差异较大，16 S rRNA两序列中存在43处碱基变异，COI序列中检测到117处碱基变异。小孔蛸隶属小孔蛸属，却与蛸属的其他种类有较近的亲缘关系，而同属于蛸属的长蛸则较远。 采用AFP分子遗传标记技术，对中国沿海大连、烟台、青岛、连云港、舟山5个地理群体长蛸的遗传多样性进行研究。采用4对AFLP引物组合对5个群体的150个个体进行扩增，共得到190个的位点，5个群体内的多态位点比例为64．29％-89．13％，总多态位点比例为73．16％。群体的Nei’s基因多样性指数（H）为0．0885-0．1272，Shannon多样性指数为0．1293-0．1890，群体间的遗传距离为0．0304-0．0842，遗传分化系数（Fst）值为0．18360；根据5个群体之间的遗传距离（D）、遗传相似度（S）以及用NJ和UPGMA法聚类分析发现，LY和ZS亲缘关最近，DL和LY亲缘关系最远。聚类结果显示，5个群体分成两个分支，DL群体和YT群体聚在一起，成为一个分支。LY群体和ZS群体聚在一起，然后与QD群体聚在一起，形成另一支；分子变异（AMOVA）分析表明，长蛸群体遗传变异主要来源于群体内。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1 长蛸(O.variabilis)概述

1.1 分类地位

1.2 形态结构

1.3 生活习性及生活史

1.4 渔业

2 长蛸的理论研究和经济价值

2.1 理论研究

2.2 经济价值

3 生物的遗传多样性

3.1 概述

3.2 遗传多样性研究方法

3.3 分子标记发展概况

4 遗传标记技术在水产动物研究中的应用

4.1 应用于种质鉴定与系统进化的研究

4.2 群体遗传与分化

4.3 水产动物遗传图谱的构建

4.4 经济性状的定位

4.5 DNA分子标记辅助育种

4.6 监测遗传渐渗和物种遗传多样性

5 遗传标记技术在长蛸等头足类中的研究进展

5.1 形态标记

5.2 细胞学标记

5.3 生化标记

5.4 分子标记

6 研究内容和意义

第一章 中国沿海长蛸自然群体线粒体COI基因遗传多样性研究

1 概述

2 实验材料

3 实验方法

3.1 基因组总DNA的提取

3.2 基因组DNA的检测

3.3 PCR扩增

3.4 PCR产物纯化

3.5 测序

4 数据处理与分析

5 结果

5.1 基因组DNA的提取

5.2 目的片段的扩增、纯化、序列测定及碱基特性

5.3 COI基因片段的多态性分析

5.4 长蛸各群体内遗传多样性分析

5.5 长蛸各群体间遗传多样性分析

5.6 长蛸群体遗传变异和遗传结构

5.7 长蛸群体遗传分化和聚类分析

6 讨论

第二章 长蛸和小孔蛸线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究

1 概述

2 实验材料

3 实验方法

3.1 基因组DNA的提取

3.2 基因组DNA的检测

3.3 PCR扩增mtDNA目的基因片段

3.4 PCR产物的纯化及目的片段序列的测定

3.5 实验数据处理和分析

4 结果

4.1 基因组总DNA的提取

4.2 目的片段的扩增和序列测定

4.3 长蛸、小孔蛸线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的特性及差异

4.4 两种蛸类的线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列与其他蛸类的差异

4.59 种蛸类的遗传距离与系统进化关系

5 讨论

第三章 长蛸AFLP分析体系的优化与建立

1 概述

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试剂和仪器设备

3 AFLP实验过程

3.1 基因组DNA模板的制备

3.2 基因组DNA的酶切

3.3 接头的连接

3.4 预扩增

3.5 选择性扩增

3.6 扩增产物的检测

4 结果与讨论

4.1 基因组DNA

4.2 酶切与连接时间

4.3 预扩增与选择扩增

4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳后的银染结果

4.5 扩增带谱的特点与筛选结果

结论

第四章 5 个不同地理群体长蛸遗传多样性的AFLP分析

1 概述

2 材料

3 实验方法

3.1 基因组总DNA的提取

3.2 AFLP分析

3.3 数据统计与分析

4 结果与分析

4.1 AFLP扩增结果

4.2 地理群体的遗传结构及遗传多样性分析

4.3 相对遗传距离和聚类分析

5 讨论

结论

参考文献

致谢