短蛸四个地理群体遗传多样性研究

摘要

短蛸（Octopus ocellatus）属头足纲，蛸亚纲，八腕目，蛸科，蛸属。我国南北沿海均有分布，主要群体栖居于温带偏北海域，在黄、渤海产量较大，山东的青岛、烟台、威海，辽宁的大连、营口，河北的乐亭产量较多，是我国北部沿海蛸类中最重要的经济种之一。近年来随着渔业捕捞强度的加大，短蛸自然资源和种质遗传多样性正面临着日益严重的破坏。因此，摸清短蛸遗传多样性水平，开展人工育苗及养殖迫在眉睫。而近年来发展起来的DNA标记技术所具有的稳定性、可靠性和准确性使其能够准确的反应生物的遗传信息。本文利用AFLP和线粒体DNA COI基因两种研究方法对我国北方近海四个野生短蛸群体的遗传结构和遗传变异进行了研究，并且比较了线粒体DNA16S rRNA基因和COI基因的序列差异，以期了解短蛸的遗传背景和为接下来的遗传育种工作提供理论基础。 通过AFLP技术对四个群体的短蛸进行遗传多样性分析，所筛选的六对引物E33M54，E39M54、E44M60、E35M58、E42M58和E38M49共扩增得到303个位点，其中多态位点比率最高的是大连群体（DL），为67．93％，最低的是青岛群体（QD），为62．03％。Shannon多样性指数的变化范围在0．3467～0．3893之间，Nei指数（H）的变化范围在0．2353～0．2617之间，群体间的遗传距离为0．0497～0．085，大连群体的多态位点比例、Shannon多样性指数和群体Nei's基因多样性指数均高于其他三个群体。AMOVA分析的结果显示：短蛸群体88．28％的变异来源于群体内，群体间的变异仅占11．72％，显示短蛸的遗传变异主要来源于群体内，但群体间已经有了一定程度的遗传分化。 采用聚合酶链式反应（PCR）技术对中国北部沿海短蛸4个自然群体31个野生个体的COI基因片段进行了扩增和测序，经比对获得709bp的碱基序列。其中碱基A、T、G和C的平均含量分别为38．5％、28．6％、18．0％和15．0％，A+T的含量明显高于G+C的含量。结果发现3个插入/缺失突变的核苷酸位点，检测到26个多态性核苷酸位点，18种单倍型，其中2种共享单倍型。MEGA3．1计算群体间遗传距离，大连和青岛遗传距离最远，为0．0052，青岛和连云港遗传距离最近，为0．0029。AMOVA分析表明，四群体间总遗传分化系数Fst=0．11439，说明变异主要来自于群体内，但是群体间已经有了一定程度的遗传分化。群体内，大连和烟台群体的核苷酸差异数K以及平均核苷酸多样性指数Pi最高，连云港群体最低；群体间，大连群体在群体间核苷酸差异数K、群体间平均每位点核苷酸替代数Dxy和群体间每位点净核苷酸替代数Da三个指标上都表现出比其它群体较高的水平，说明大连群体具有最为丰富的遗传多样性。利用COI基因序列构建的UPGMA分子系统树显示各群体没有明显的聚类。 采用PCR扩增和序列测定等技术，对短蛸（Octopus ocellatus）线粒体DNA的16S rRNA和COI基因片段进行了初步研究。经PCR扩增和序列测定，分别得到16S rRNA和COI两个基因片段的碱基序列，其中16S rRNA基因片段的大小为554bp，碱基A，T，G，C的含量分别为38．1％、11．0％、33．6％、17．2％； COI基因片段的大小为709bp，碱基A，T，G，C的含量分别为28．6％、14．9％、38．5％、18．0％；在2种基因片段中，A+T含量均明显高于G+C含量。在3个样本中，16SrRNA基因片段有2个插入/缺失位点，2个转换位点；COI基因片段中有1个插入觖失位点，一个转换位点，2个颠换位点。另外，比较本研究所得序列与GenBank中八腕目其他8个科9个种的COI和16S rRNA基因片段序列后，发现其聚类结果与传统分类基本上是一致的。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

1 短蛸(Octopus ocellatus)概述

1.1 分类地位及地理分布

1.2 形态结构

1.3 生物学特性及生活史

1.4 经济价值

2 遗传标记技术的发展状况

2.1 遗传标记的发展及其类型

2.2 分子标记的种类

2.3 各种分子标记的比较及相互关系

3 分子标记技术的应用及发展前景

3.1 分子标记技术与生物多样性保护

3.2 分子标记技术在水产动物研究中的应用

3.3 分子标记技术的发展前景

4 国内外短蛸及其它蛸科头足类的研究概况

4.1 生物学及渔业研究

4.2 组织形态学研究

4.3 遗传学研究

5 本研究的目的及意义

第二章 短蛸四个不同地理群体遗传多样性的AFLP分析

1 概述

2 材料

2.1 实验材料

2.2.主要仪器设备

2.3 主要生化试剂及溶液配制

3 实验方法

3.1 模板DNA制各

3.2 AFLP反应流程

3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶检测

4 数据整理

5 结果与分析

5.1 DNA提取结果

5.2 酶切结果

5.3 预扩增结果

5.4 引物筛选及选择性扩增结果

5.5 遗传多样性分析

5.6.聚类分析

6 讨论

6.1 试验方法及条件优化

6.2 AFLP技术在短蛸遗传多样性研究中的优越性

6.3 本研究结果与其他相关研究的比较

6.4 短蛸群体遗传变异与分化

6.5 短蛸群体遗传资源的开发利用及展望

第三章 四个短蛸地理群体线粒体DNA COI序列分析

1 引 言

2 材料

3.实验方法

3.1 总DNA的提取

3.2 引物合成

3.3 PCR扩增

3.4 PCR产物的回收

3.5 PCR产物的连接转化

3.6 阳性克隆的检测与测序

3.7 序列比对与遗传多样性分析

4 结果与分析

4.1.DNA提取结果

4.2 PCR扩增结果

4.3 胶回收结果

4.4 阳性克隆检测结果

4.5 序列组成分析

4.6 mtDNA COI基因片段的多态性分析

4.7 短蛸各群体内遗传多样性分析

4.8 短蛸各群体间遗传多样性分析

4.9 短蛸4 个群体间遗传距离及群体遗传分化

4.10 分子系统树的构建

5 讨论

第四章 短蛸线粒体16S rRNA和COI基因序列比较及系统发生研究

1 引 言

2 材料和方法

2.1 样品的收集和DNA的提取

2.2 PCR扩增、克隆和测序

2.3 序列分析

3 结 果

3.1 短蛸COI基因扩增及测序结果

3.2 短蛸16S rRNA基因扩增及测序结果

3.3 两个基因片段与其它八腕目外群种类相应序列比对结果

4 讨论

4.1 两个基因片段的碱基组成

4.2 两个基因片段的遗传变异

4.3 分子系统发生树

结 论

参考文献

致谢