鲮MRFs家族基因克隆与Myf5因子的SNPs分析

摘要

鲮(Cirrhinus molitorella)属鲤形目、鲤科、野鲮亚科、鲮属。俗称土鲮鱼、鲮公、雪魿、花鲮。分布于珠江、闽江、韩江、海南岛、台湾岛、元江及澜沧江水系，国外见于东南亚。鲮在珠江流域地区与草鱼，鲢，鳙合称四大家鱼，是江河捕捞和池塘养殖的主要对象之一。
　　 生肌调节因子MRFs家族包括Myf5,MyoG,MyoD和Myf6四成员，基本功能是促进成肌细胞的增殖和分化，其中MyoD,Myf5决定着肌卫星细胞是否能启动成为具有成肌特性的肌肉干细胞，而MyoG和Myf6则发挥着调节肌肉干细胞终末分化为肌管肌纤维的功能。通过MRFs家族基因的典型性的碱性bHLH螺旋-环-螺旋结构它们能够与E蛋白形成二聚体，再与肌肉特异性基因如肌球蛋白轻链基因和肌酸激酶等的上游调控序列E-box结合，从而激活这些基因的表达。
　　 本实验以珠江水珠江水系的东江，北江，西江3个江段种群的野生鲮作为试验对象，先克隆到MRFs家族基因的cDNA序列并进一步获得基因组序列，再利用生物信息学方法，分析其基因结构、蛋白质结构、并预测基本生物学功能，通过SSCP(single strand conformation polymorphism，SSCP)的方法对鲮Myf5基因进行SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)检测，以获得与生长性状相关的SNPs位点，并对该位点的基因型在各江段种群中的遗传分布及群体遗传结构进行研究，为鲮分子标记辅助育种奠定基础。同时构建了两种等位基因型的pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5真核表达载体，通过肌肉注射法注入鲮鱼部肌肉，观察体内过量表达Myf5基因对鱼体胚后时期的肌肉促生长作用。还利用定量-PCR和免疫组化技术，鉴定不同水平的表达情况，分析野生型与突变型Myf5基因对肌肉纤维生长的影响，为生肌调节因子MRFs家族在鱼类肌肉生长发育过程中的作用机制的研究奠定基础。
　　 以下为实验主要内容：
　　 1生肌调节因子MRFs家族基因克隆：通过RT-PCR技术，Gene-walking技术，以及热不对称-PCR技术克隆获得MRFs家族基因各成员的cDNA序列和基因序列。获得Myf5基因序列为2516bp,cDNA序列1115bp，ORF框为723bp，有3个外显子和2个内含子，编码239个氨基酸残基组成的蛋白质分子；获得Myod基因序列为1596bp.cDNA序列1196bp,ORF框为828bp，有3个外显子和2个内含子，编码275个氨基酸残基组成的蛋白质分子：获得Myog基因序列为2595bp，cDNA序列1322bp，ORF框为762bp，有3个外显子和2个内含子，编码253个氨基酸残基组成的蛋白质分子；获得myf6基因序列为1461bp， cDNA序列765bp, ORF框为762bp，有3个外显子和2个内含子，编码238个氨基酸残基组成的蛋白质分子；通过在线分子生物信息预测其蛋白质的一级结构，以及二级结构，并发现在蛋白质空间结构上，都含有相同的B-HLH结构。
　　 2通过SSCP的方法对鲮Myf5基因进行SNPs检测，以获得与生长性状相关的SNPs位点：
　　 用单链构向多态性SSCP的方法分析了Myf5基因在珠江水系3个不同江段鲮中的遗传变异，分布及群体杂合性等群体遗传信息。发现其编码区非常保守，仅在外显子412位点处发生突变C→T。对该位点进行基因型分析，结果表明：北江段鲮中该位点符合Hardy-Weinberg平衡，而东江和西江段种群不符合Hardy-Weinberg平衡，3个江段种群总体上符合Hardy-Weinberg平衡，存在较大基因流，并以Myf5基因该位点的多态性分析表明，3个种群未出现明显分化；通过该位点的遗传结构分析表明：3个江段种群杂合度都较高，中度信息含量(PIC)及多态信息指数，即该位点有较好的变异性及遗传多态性。3个江段种群总体上该位点在不符合Hardy-Weinberg的情况下AA＞BB，并由该位点群体杂合性及中性分析表明该位点突变群体具体良好的多态性且不遵循中性选择模式，说明BB型个体受到自然选择。鲮Myf5基因的C412T与其生长有相关性，可作为候选基因标记，用于鲮生长相关分子标记辅助育种研究。
　　 3构建pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5表达载体重组子(预实验结果)：
　　 根据获得的基因序列，设计引物，再通过RT-PCR获得两种型的ORF。将野生型和突变型Myf5基因的ORF定向克隆至pcDNA3.1(-)/mycHisB载体。以鱼生理盐水溶解重组子，分别在同一条鱼的两测注射。分别在0h、12h、24h、36h、48h提取RNA作表达在RNA水平检测，分析两种表达载体重组子表达量及不同时间段表达量的变化，30天之后作免疫组化检测蛋白水平表达。RNA水平检测表明有明显提高Myf5基因表达量，免疫组化检测蛋白水平也表明外源载体在肌肉内有表达。

目录

文摘

英文文摘

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前言

1 野生鲮鱼分布与养殖现状介绍

2 分子辅助育种中常用的分子标记

3 国内外关于与生长相关的功能基因的研究现状

4 鱼类骨骼肌的发生与成肌调节因子MRFs

5 国内外关于与生长相关基因SNPS技术的研究现状

6 国内外在水产方面关于SNPs的研究进展

第一章 鲮鱼生肌调节因子(MRFs)家族基因cDNA序列及基因序列的克隆与分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要试剂及引物合成

1.3 基因组DNA与总RNA提取

1.4 RT-PCR与PCR扩增

1.5 PCR扩增产物的克隆和测序

1.6 生物信息学分析序列分析

2 结果与分析

2.1 提取的DNA，RNA如图

2.2 MRFs家族基因PCR扩增结果：CDNA序列及推测的AA序列

2.3 各家族成员的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)结构

2.4 MRFs家族基因克隆结果

3 讨论

第二章 鲮Myf5基因的SNPs分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 DNA的提取

1.3 引物合成与PCR扩增

1.4 PCR-SSCP分析

1.5 统计分析

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP结果分析

2.2 该位点在不同江段鲮的基因型和基因频率统计以及遗传变异结果

3 讨论

第三章Myf5 真核表达载体的构建及其在鱼体中的表达初步分析(预实验)

1 实验材料

1.1 实验鱼

1.2 克隆质粒和菌株

1.3 引物和酶

1.4 试剂盒

1.5 免疫组化试剂

2 实验方法

2.1 重组子Myf5基因的改造

2.2 重组质粒的构建.

2.3 转化子的筛选与鉴定

2.4 pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5在鱼体内的表达检测

3 实验结果

3.1 pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5重组质粒的构建

3.2 RNA水平表达的变化初步结果

3.3 免疫组化实验检测翻译水平的表达

4 讨论

4.1 真核表达载体pcDNA3.1(-)/mycHis的选择

4.2 外源质料直接注射法与基因表达

展望

1. 过量表达外源Myf5基因对肌纤维直径和密度的影响

2 野生型和突变型外源Myf5基因在体内表达对肌纤维的影响

全文总结

参考文献

附录1 中英方对照缩略词表(Abbreviations)

附录2 pcDNA3.1(-)/mycHisB载体图

附录3 常用试剂与缓冲液的配制

在读期间取得成果

致谢