鱼类P450诱导剂和抑制剂在草鱼体内外对双氟沙星N-脱甲基化代谢的影响

摘要

细胞色素P450(CYP)是动物体内代谢药物的重要的酶。CYP1A、3A和2E的诱导和抑制作用己被广泛研究，其诱导剂和抑制剂已经比较明了，但关于鱼类P450诱导剂和抑制剂对双氟沙星N-脱甲基化影响的研究却未见报道。本文采用RP-HPLC的方法研究了鱼类P450的典型诱导剂和抑制剂对双氟沙星N-脱甲基化影响，预测了参与双氟沙星N-脱甲基化代谢的主要的P450酶。本论文的研究内容分为五章：第一章是草鱼肝和肾中双氟沙星和沙拉沙星共检出方法的比较研究；第二章是鱼类诱导剂和抑制剂在体外对双氟沙星N-脱甲基化的作用；第三章是鱼类诱导剂和抑制剂在体内对双氟沙星N-脱甲基化的作用：第四章是双氟沙星对草鱼肝和肾组织的损伤模型的初步建立；第五章是实验用鱼的多功能口服给药装置的专利申请。主要内容如下：
　　 1草鱼肝和肾中双氟沙星和沙拉沙星共检出方法的比较研究
　　 以草鱼肝和肾组织为研究对象，比较了反相高效液相色谱法测定同时测定双氟沙星和沙拉沙星的内标法和外标法。外标法和内标法(以诺氟沙星为内标)均采用有机溶剂二氯甲烷提取样品中的药物，45℃吹干，流动相溶解，正已烷去脂，反相高效液相色谱法测定其中的药物浓度。利用外标法测得DIF的平均回收率在肝和肾中分别为82.41％和82.13％，各样品日内变异系数分别小于4.79％和4.92％；SAR的平均回收率在肝和肾中分别为82.02％和81.94％，各样品日内变异系数分别小于4.96％和5.06％；利用内标法测得DIF的平均同收率在肝和肾中分别为82.32％和82.17％，各样品日内变异系数分别小于4.92％和4.73％：SAR的平均回收率在肝和肾中分别为82.06％和82.13％，各样品日内变异系数分别小于4.92％和4.52％。外标法测得肝中DIF和SAR的LOD为0.01和0.02μg·g-1，肾中DIF和SAR的LOD为0.02和0.05μg·g-1，肝和肾中DIF和SAR的LOQ均为0.05μg·g-1：内标法测得肝中DIF和SAR的LOD均为0.02μg·g-1，肾中DIF和SAR的LOD为0.02和0.05μg·g-1，肝和肾中DIF和SAR的LOQ均为0.05μg·g-1。综合内标法和外标法的优缺点和上述实验结果，本实验选择外标法检测肝和肾组织中双氟沙星和沙拉沙星的含量。
　　 2双氟沙星对草鱼肝细胞和肾细胞的毒性实验
　　 细胞的传代培养、冻存与复苏采用实验室常规的方法。细胞中蛋白含量检测采用Lowry法，肝细胞中蛋白浓度为0.39mg/ml细胞，肾巾蛋白浓度为0.35mg/ml细胞。采用MTT法分析了双氟沙星在浓度分别为3.9、7.81、15.6、31.25、62.5、125、250、500和1000μM，对草鱼肝细胞和肾细胞分别作用1h、2h、6h、12h、24h和48h之后，其结果表明肝细胞和肾细胞中选择DIF浓度为3.9～125μM和细胞孵育的时间为1～6h，作为后续优化DIF N-脱甲基化代谢研究的最高非致死浓度，为进一步研究双氟沙星在肝和肾细胞中最佳代谢时间和浓度提供依据。
　　 3鱼CYP诱导剂在草鱼肝细胞和肾细胞中对双氟沙星N-脱甲基的作用
　　 为获得有关CYP诱导的信息，本研究采用RP-HPLC的方法在GCL和CIK细胞中测定了CYP(s)的特异性诱导剂对DIF的代谢作用及酶动学分析。GCL的BNF处理组导致了DIF代谢水平5.1倍增加，而RIF处理组引起DIF代谢水平2.5倍增加，EA处理组对DIF代谢水平没有明显改变，BNF诱导组和对照组的酶动学方程分别为1/V=0.0157×1/[S]+0.001和1/V=0.0673×1/[S]+0.0029，与对照相比，BNF导致Vmax1.9倍增加，Clint3.3倍增加。而在CIK中，DIF与经BNF处理的CIK共孵育后，DIF的N-脱甲基化代谢水平有3倍增加，BNF诱导组和对照组的酶动学方程分别为1/V=0.0245×1/[S]+0.0013和1/V=0.1375×1/[S]+0.003,酶动学参数Clint和Vmax值分别增加了6倍和2倍，EA和RIF诱导组均使对Clint和Vmax值改变很小。BNF是鱼类CYP1A的特异性诱导剂，RIF是鱼类CYP3A的强的诱导剂，因此，在本研究条件下，CYP1A和3A参与了GCL的DIF N-脱甲基化代谢，CYP1A参与了CIK中DIF的N-脱甲基化代谢。
　　 4鱼类诱导剂和抑制剂在体内对双氟沙星N-脱甲基化的作用
　　 通过用鱼类典型的诱导剂BNF(CYP1A)、EA(CYP2E)和RIF(CYP3A)和强抑制剂ANF(CYP1A), EF(CYP2E)和KTZ(CYP3A)对DIF N-脱甲基化的作用。采用RP-HPLC方法检测DIF的代谢产物SAR的产量，间接反应CYP酶对组织样品中DIF-脱甲基化活性。SAR的生成量表明，在草鱼的肝和肾中，ANF和BNF组在第三天时分别达到最大抑制和诱导，BNF诱导组的诱导率和ANF的抑制率高于25％。EA、EF、RIF和KTZ处理草鱼，抑制和诱导率低于20％。酶动学参数表明，在肾中BNF引起Vmax和Clint0.56和0.38倍增加，而在肝中BNF引起Vmax和Clint两者都有1倍增加，EA和RIF处理组的Vmax和Clint与对照相比，差异不显著。在肝和肾中，ANF预处理的DIF脱甲基化抑制的Lineweaver-Burk plot表明了混合类型的抑制，而EF和KTZ没有显示对DIF脱甲基化的抑制效应。ANF对鱼肾中DIF的代谢的抑制常数(Ki)为12.9mg/kg体重，而ANF对鱼肝中DIF的代谢的抑制常数(Ki)为12.53mg/kg体重。综上，由于BNF和ANF分别为CYP1A的诱导剂和抑制剂，CYP1A参与了草鱼肝和肾中的DIF的N-脱甲基化。
　　 5双氟沙星对草鱼肝和肾组织的损伤模型的初步建立
　　 有些药物或毒物可通过许多方式对肝脏和肾脏造成损害。喹诺酮类药物对鱼类组织损伤模型未见报道，本实验研究了双氟沙星对草鱼肝脏和肾脏组织损伤的具体组织病理学变化。给草鱼连续灌20mg/kg的双氟沙星20天后，在观察症状和剖检变化后，以后对存活的鱼取其肝脏组织和肾脏组织，进行石蜡切片，HE染色，显微镜观察。眼观无病变，显微病变为肝脏毛细血管充血，肝细胞出现空泡变性或玻璃样变性。肾脏有出血，肾曲小管组织溶解，机化或化生，肾小球的细胞核肿胀。双氟沙星对草鱼肝和肾组织的损伤模型的初步建立为探知肝脏和肾脏疾病的病因、病理等提供有力的工具。
　　 6实验用鱼的多功能口服给药装置的专利设计
　　 给鱼灌药的过程中，现存管制装置容易使胃肠液和液体渔药溢出，并且末端容易损伤鱼的肠胃。针对这些难题，设计了一实用新型专利。已获得专利受理申请书，申请号为2010201068441。

目录

文摘

英文文摘

上海海洋大学博士学位论文答辩委员会成员名单

引言

1 细胞色素P450的研究概况

2 细胞色素P450的应用

3 鱼类细胞色素P450的研究进展

4 喹诺酮类药物与P450活性关系研究进展

5 实验动物研究中的动物福利

6 本论文研究的目的、意义与主要内容

第一章 草鱼肝和肾中双氟沙星和沙拉沙星共检出方法的比较研究

1 材料与方法

2 结果

2.1 色谱行为

2.2 定量方法

3 讨论

第二章 鱼类CYP诱导剂在体外对双氟沙星N-脱甲基化的作用

第一节 细胞培养及基本指标检测

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 双氟沙星对草鱼肝细胞和肾细胞的毒性实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三节 鱼CYP诱导剂在草鱼肝和肾细胞中对双氟沙星N-脱甲基的作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 鱼类诱导剂和抑制剂在草鱼体内对双氟沙星N-脱甲基化的作用

1 材料与方法

2 结果

2.1 不同诱导剂和抑制剂对DIF代谢的作用

2.2 DIF代谢的脱甲基化的酶动学分析

3 讨论

第四章 双氟少星对草鱼肝和肾组织的损伤模型的初步建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第五章 实验用鱼的多功能口服给药装置的专利设计

1 在给鱼灌药过程中遇到的困难

2 专利申请设计思路

3 专利使用说明详述

小结

创新点

参考文献

附录

缩略词

发表的文章、申请的专利及参加会议情况

致谢