乌鳢、斑鳢性别差异SSR标记的初步筛选及其遗传多样性分析

摘要

乌鳢(Channaaggus)和斑鳢(Channamaculata)，同属鲈形目(Perciformes)、鳢科(Channidae)、鳢属(Channa)，是重要的淡水经济鱼类，具有肉鲜味美，营养丰富，无肌间刺，易养殖，生长速度快等特点。乌鳢分布相对较广，除高原地区外，主要分布于长江流域以及北至黑龙江一带，尤以湖北、江西、安徽、河南、辽宁等省居多。乌鳢的黑龙江亚种主要分布于黑龙江流域的南部以及乌苏里江流域和兴凯湖、松花江等沼泽地带。斑鳢则分布于长江流域以南地区，尤其是广东、广西、台湾、福建、云南等地较常见。
　　 乌鳢比斑鳢分布广，以食小杂鱼、冰鲜鱼为主，较难驯食人工配合饲料，无疑增加了养殖成本。斑鳢经过长期驯化，虽可食饲料，但不耐低温。在养殖实践中，人们发现以乌鳢作为父本与斑鳢杂交的F1代，综合了亲本的优点，且其雌雄个体生长速度差异很大，成鱼中雄性平均体重超过雌性的2倍。因此，开展杂交鳢全雄育种技术研究，对于提高杂交鳢的养殖产量和经济效益具有重要意义。本实验利用目前最为有效的分子标记手段之一的SSR技术，寻找乌鳢和斑鳢性别特异的分子标记，为其育种工作提供辅助手段。同时，本研究以野生和养殖的乌鳢和斑鳢为研究对象，采用SSR，分析了两者的遗传多样性，初步了解其遗传资源状况，为杂交鳢育种选择合适的亲本奠定基础。另外，尝试用微卫星对乌鳢(♂)、斑鳢(♀)及其杂交种进行了分析，以确保充分合理利用资源。本文的主要工作和结论如下所述：
　　 1.采用SSR结合BSA的技术对1个家系96个乌鳢个体(雌雄各48个)进行性别差异标记的筛选。首先构建了雌雄基因池(各24个个体)，然后用140对微卫星引物对其进行扫描，发现了3对引物(HLJWL17，HLJWL59，HLJWL70)在雌雄基因池间扩增出了差异条带，且都出现在雌性基因池中。用构建基因池的共48个个体对3对引物进行第一轮单个体验证，HLJWL17和HLJWL70在基因池中扩增出的差异条带仅在极个别个体中出现，而HLJWL59的差异条带在绝大多数的雌性个体中被成功扩增出来，雄性个体皆无。用其余的48个个体对HLJWL59进行第二轮单个体验证，得到同样结果。对HLJWL59在8个雌性个体中扩增出来的差异基因片段进行克隆并测序。将8个个体的测序结果用Vector8.0进行多序列比对，证实各个个体得到的条带是同一序列，该序列长度为243bp，以TGC为重复单位，GC含量为51％。通过BLASTn比对，发现在GenBank数据库中无同源性序列存在。经统计，此差异标记在雌性乌鳢中出现的概率为62.5％，即该标记对该家系乌鳢性别的正确判别率为81.25％。利用乌鳢的139个SSR引物组合，扫描斑鳢雌雄群体的基因组DNA，其中3个引物组合在基因池中扩增出了2个雌性性别特异的和2个雄性性别特异的DNA条带。但在个体验证中，这些特异性条带消失，说明这些条带不是目的条带。
　　 2.从16对引物中挑选8对扩增效果好的SSR引物组合，对斑鳢的2个野生群体和2个养殖群体进行了研究和分析，首次对斑鳢的资源现状进行了报告。4个群体检测到的等位基因数分别为：12、20、16、20，斑鳢养殖群体检测到的等位基因数比其野生群体已有较明显的减少，从HLJWL115扩增的电泳结果图可以明显看出，郁南(YN)群体具有一个明显的特有等位基因，四个群体中，以郁南(YN)野生斑鳢的多态信息含量最高，为0.4148；其次为花都(HD)野生群体，为0.4028；然后是中山(ZS)养殖群体，为0.2014；而佛山(FS)养殖斑鳢的最低，为0.1523，这表明这些座位在养殖群体中多态性明显下降，遗传距离中，FS和ZS的最短，为0.0616，而FS和YN的距离最远，为0.3168。同时利用34个SSR引物组合，对乌鳢养殖群体30个个体和野生个体19个个体进行了遗传结构分析。除了5个单态位点外，绝大多数的等位基因为两个群体共有，同时发现野生群体的一些稀少等位基因在养殖群体中消失；在有效等位基因数、多态信息含量方面，乌鳢野生群体均高于养殖群体。从一定程度上说明，养殖群体的遗传多样性已下降。
　　 3.以乌鳢(♂)、斑鳢(♀)及其杂交种为材料，进行SSR标记分析。从139对引物中，筛选出41对能稳定扩增，且带型清晰的引物。从中随机选取14对引物作为乌鳢、斑鳢和杂交鳢F1种质鉴定的特异引物进行扩增。8对引物表现出“双亲互补型”，3对为“偏父型”，1对表现出“偏母型”，2对为“杂种型”。所选SSR引物8对能对乌鳢、斑鳢及其杂交种进行区分，3对能将杂交种与母本区分开，1对能区分开杂交种与父本，显示出SSR标记技术在杂交鳢鉴定方面的广泛应用前景。