中华绒螯蟹miRNA的分离及在卵母细胞成熟过程中的表达分析

摘要

microRNA(miRNA)是一类大小在22~24nt、非编码的内源小分子RNA。其成熟体由经Dicer切割前体而成,可与Ago蛋白形成沉默复合物RISC、结合靶基因的3'UTR,抑制其表达或翻译。在植物中,miRNA与靶基因完全互补,以降解 mRNA的方式进行调控;而在动物中,miRNA仅5'端的第2~8个碱基(种子区域)与靶基因结合位点完全互补,其他部位部分互补,以抑制 mRNA翻译的方式在蛋白水平进行调控。目前,在多个物种的卵巢中都克隆到了miRNAs,但多数miRNAs在卵巢成熟过程中的功能还尚不清楚。在节肢动物门中,昆虫纲报道的miRNA比较多,在甲壳纲中只有水溞获得了43个miRNAs,而在虾蟹中还未见报道。
　　中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)在我国水产经济中占有重要的地位。近年来,对于中华绒螯蟹卵母细胞成熟的研究主要集中在组织学和细胞学水平,对卵母细胞成熟分子机制的研究较少。为了探究miRNAs在卵母细胞成熟过程中的作用,本文利用solexa高通量测序获得中华绒螯蟹四个发育时期(即卵黄发生前期pVt、卵黄发生期Vt、生发泡期GV以及生发泡破裂期GVBD)卵巢小RNA序列信息,通过与Sanger miRbase数据库中成熟的miRNA序列以及近缘物种水溞、果蝇的基因组进行比对,共得到了220个miRNAs,其中62个为已知的miRNAs,分别属于44个家族;其余136个为新的miRNA candidates。在62个已知的miRNAs中,miR-184的阅读数丰度最高,而miR-100和let-7的阅读数丰度次之,说明这些miRNAs可能在卵母细胞成熟过程中起着重要的调控作用。在获得的小 RNA序列中,长度主要分布在21nt~24nt和25nt~26nt,说明可能在中华绒螯蟹卵巢中存在着大量的piRNA。
　　根据 miRbase数据库中所登录的各物种中成熟的miRNA序列及保守性,将62个已知的中华绒螯蟹 miRNAs归类到44家族后,进行进化分析。结果表明,有19个miRNA家族在脊椎动物和无脊椎动物中存在,而23个miRNA家族和两个未知家族miRNA仅存在于无脊椎动物中。其中有7个miRNA家族和miR-2779仅存在于节肢动物中,说明他们可能在节肢动物特有的生物学现象中执行重要的功能,如蜕皮等。miR-252 family和miR-71 family的三个miRNA仅存在于无脊椎动物和文昌鱼中,因此推测这两个家族的miRNA可能在低等无脊椎动物到高等脊椎动物的进化过程中逐渐被淘汰。大多数的miRNA在脊椎动物和无脊椎动物中都高度保守,如 miR-1和let-7。而bantam和miR-2279在种子区域发生了突变，miR-275、miR-282、miR-305、miR-307和miR-315在非种子区域都发生了碱基置换。miRNA*中miR-8*在无脊椎动物中相对比较保守,仅在一个位点发生了碱基置换。
　　我们从NCBI中选择全长在1000bp以上,3'UTR长度在300bp以上的17个mRNA序列,利用RNAhybrid在线软件将其与已知的62种miRNAs进行靶基因预测。其中功能涵盖了卵巢成熟、性腺发育、转录调控以及免疫等等。Cyclin B和Cdc2激酶是中华绒螯蟹卵巢成熟调控因子MPF的重要组成部分,中华绒螯蟹蟹cyclin B的超长3'UTR上发现了三个特殊的基序,分别为Brd-box(AGCUUUA)、GY-box(GUCUUCC)和K-box(cUGUGAUa)。在果蝇中,已经证实三种box介导负的转录后调控,由于miRNA较保守,因此可能调控作用在物种间也比较保守。因此推测在中华绒螯蟹中miRNAs可能box元件对cyclin B也进行调控。通过测序,我们获得了与三种box结合的mir-2、miR-7和miR-79。经预测cyclin B结合的miRNA有19个,而结合位点有54个。在以三种box为结合位点的miRNA中,而以K-box为调控元件的miR-2的结合自由能最低为-24.0kcal/mol,以 GY-box为结合位点的miR-7结合自由能为-21.4kcal/mol,以Brd-box为结合位点的miR-79的结合自由能最低为-17.0kcal/mol。与cdc2激酶结合的miRNA有8个,共有10个结合位点。miR-252a与cdc2激酶3’UTR的结合的自由能值最低,为-27.2kcal/mol。
　　为了比较与box结合的三种miRNA在卵子发生过程中,尤其是最终卵母细胞成熟的表达情况,我们对三个miRNAs在四个卵巢时期的表达进行定量。从荧光定量结果中可以看出,U6内参基因在各个时期表达量稳定,可用于荧光定量内参。miR-2在pVt期表达量较高,而在Vt期表达量下降到最低(p<0.01)。在GV期表达量上升,表达量比Vt期增加了3.2倍,并在GVBD期表达量上升最高,表达量比Vt期增加了11.9倍。miR-7在前三个时期表达量无显著性变化,在GVBD期miR-7表达量上升到最高,表达量比前三个时期增加了0.3倍。miR-79在前三个时期表达量无显著性变化,在GVBD期的表达量下降为pVt的一半(p<0.05)。对比cyclin B mRNA在卵子发生过程中表达量,cyclin B在pVt的表达量最高,而在Vt期下降到最低,到了GV期又急剧上升,并在GVBD表达量达到最高。Cyclin B与miR-2在卵子发生过程中表达模式类似,鉴于miRNA大多为负调控因子,因此推测miR-2并未影响cyclin B mRNA表达水平,高表达的miR-2可能在GVBD后对于cyclin B蛋白的翻译具有抑制作用。有趣的是,在测序结果中,同时得到了miR-2和miR-2*,根据二者设计引物扩增到了近60bp的片段。经同源性比对后,发现与水溞miR-2前体同源性较高,并且可以折叠成发卡结构,说明miR-2前体可以形成两个成熟的miRNAs,抑制效果可能更强。MiR-7的表达仅在GVBD期显著性升高,生发泡后期cyclin B蛋白表达量降低,说明miR-7可能从翻译水平上抑制cyclin B蛋白的表达。而miR-79在GVBD期表达量显著性降低,且靶基因预测与cyclin B的mRNA结合自由能较高,可能并未参与cyclin B的调控。
　　鉴于在三个miRNA中,miR-2与cyclin B的结合自由能最低,且其前体可以形成两个成熟的miRNA,可能抑制效果更强,因此将miR-2作为靶基因验证的最优选择。为了研究miRNAs对于卵母细胞成熟过程的作用,我们将包含三种box的cyclin B的3'UTR连接到pgl-3载体上的萤火虫荧光素酶基因的3'端。经克隆测序后,发现在cyclin B的3'UTR仅存在两个K-box,成功地构建了cyclin B靶基因载体。将UTR载体与人工合成的miR-2模拟物共转染到293T细胞中,发现荧光素酶活性下降了21.19％,统计分析P<0.01。说明cyclin B可能为miR-2的靶基因,但miR-2如何影响其表达还尚需进一步的蛋白验证,而miR-2和miR-2*是否协同调控也需要进一步的实验验证。

目录

摘要

ABSTRACT

缩写名词

第一部分 引言

1.1 miRNA 的研究概述

1.1.1 miRNA 的定义及命名规则

1.1.2 miRNA 的生物形成过程及结构特点

1.1.3 miRNA 的作用机制及功能研究

1.2 miRNA 研究方法

1.2.1 miRNA 的克隆

1.2.2 高通量测序

1.2.3 miRNA 的检测

1.2.4 靶基因预测及验证

1.3 本课题研究的理论意义

第二部分 中华绒螯蟹卵巢 miRNA 的分离及鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 样品采集

2.1.2 中华绒螯蟹不同时期卵巢 RNA 的抽提

2.1.3 中华绒螯蟹卵巢 miRNA 的 solexa 测序及分析

2.2 Solexa 测序结果与分析

2.2.1 各时期卵巢组织总 RNA 抽提结果鉴定

2.2.2 中华绒螯蟹不同发育时期卵巢内小 RNA 的 solexa 测序

2.2.3 中华绒螯蟹卵巢内 miRNA 的鉴定

2.2.4 miRNA 的进化分析

2.3 讨论

第三部分 miRNA 靶基因的预测

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.2.1 cyclin B 和 cdc2 激酶

3.2.2 MIH（molt-inhibiting hormone）基因

3.2.3 蜕皮激素调节蛋白（Ecdysteroid-regulated protein）靶基因预测

3.2.4 Cytokine signaling 2 和 ILF

3.2.5 其余 11 个 mRNA 序列的靶基因预测

3.3 结论

第四部分 三个 miRNA 在中华绒螯蟹卵母细胞过程中的表达及靶基因验证

4.1 材料与方法

4.1.1 miRNA 荧光定量分析

4.1.2 miR-2 前体的扩增及测序分析

4.1.3 cyclin B 靶基因载体的构建

4.1.4 靶基因验证

4.2 结果

4.2.1 荧光定量分析

4.2.2 miRNA 前体的扩增

4.2.3 Cyclin B 靶基因载体的构建

4.2.4 荧光报告基因检测

4.3 讨论

结论

References

附录

附录一 中华绒螯蟹卵巢 miRNAs 及 miRNA candidates

附录二 剩余 10 个基因的靶位点预测

附录三 实验所用试剂及仪器

致谢