陕西黄药子提取物体外对人食管癌细胞Eca-109抗增殖及诱导凋亡的实验研究

摘要

目的：探讨HYZ在体外对食管癌Eca-109细胞生长、增殖及周期的影响及其作用机制。 方法：1．体外培养食管癌细胞株Eca-109，倒置显微镜观察细胞形态的变化，并计算倍增时间；2．采用MTT法测定HYZ对Eca-109细胞增殖的影响；3．Hoechst33342/PI双荧光染色检测HYZ作用前后细胞凋亡情况；4．DNA Ladder技术检测HYZ作用前后细胞凋亡情况；5．流式细胞仪检测HYZ作用前后的凋亡率和周期阻滞。 结果：1-Eca-109细胞经过3天的培养、记数，计算出其倍增时间为14.69h；倒置显微镜观察对照组Eca-109细胞为贴壁生长，细胞生长速度快，形态不规则，呈三角形、梭形和多边形，核居中、大而圆，药物组细胞数量较对照减少，随HYZ作用时间的延长，越来越多的细胞由多边形变成圆形，胞质内出现空泡，体积变小，折光度下降，部分细胞脱壁呈半悬浮状态，随后细胞皱缩，裂解似爆开的“菜花”状，在10ug/ml浓度作用48h后变化最为明显。2．MTT比色实验结果显示，HYZ处理Eca-109细胞1～4d后，OD<,570>(A值)值分别比未经处理的Eca-109细胞显著下降(P<0.01)，细胞存活率随着剂量的的增大显著下降，并且随着药物的作用时间的增长而明显下降，并呈时效和量效关系；半数抑制浓度(IC<,50>)为2.5μg/ml； 10μg/mlHYZ作用Eca-109细胞48h，可明显抑制细胞生长；3．Hoechst33342/PI的结果，在荧光显微镜下观察发现，对照组活细胞大小一致，被透过活细胞膜的Hoechst33342染成蓝色，荧光均匀，少见细胞膜破裂从而被PI染成橘红色的坏死细胞。实验组细胞Hoechst33342/PI染色也呈蓝色，细胞体积缩小，胞质浓缩，胞核固缩，染色质凝集，边缘化，核碎裂，染色质分割成块，细胞呈亮珠状蓝色荧光和形成凋亡小体等典型的凋亡细胞形态改变，晚期凋亡细胞染色呈橘红色，但仍可见典型细胞核染色质凝集改变。4．琼脂糖凝胶电泳显示，Eca-109细胞其DNA在凝胶上电泳痕迹为一条距加样孔很近的大分子条带，正常分子质量100kb以上：浓度为10μg/ml的HYZ，HYZ处理后第48h提取的DNA电泳出现明显的梯状带(DNA Ladder)；5．流式细胞仪凋亡率的检测， Eca-109细胞加入10μg/ml浓度HYZ，分别作用于24、48和72h，通过亚G<,1>峰检测其凋亡率分别为(6.41±0.09)﹪、(18.38±0.11)﹪、(27.35±0.27)﹪、(17.73±1.22)﹪、(32.55±2.73)﹪，其中Eca-109细胞加入10μg/ml浓度HYZ分别作用24、48和72h与对照组相比，细胞凋亡率差异有统计学意义，t值分别为32.80、31.46、29.73和25.99，P值均为0.000。流式细胞仪检测HYZ作用后的肿瘤细胞出现亚二倍体凋亡小峰，G<,0>/G<,1>期细胞百分率明显升高，由对照组的(56.57±1.67)﹪增加到(82.24±1.38)﹪，F=139.431，P=0.000；同时处于S期的细胞数减少，由对照组的(23.43±8.55)﹪减少到(12.35±2.11)﹪，F=141.239，P=0.000。细胞出现G<,0>/G<,1>期阻滞。 结论：随着HYZ浓度和作用时间的增加对Eca-109细胞的体外抑制效应增加，HYZ通过引起Eca-109细胞G<,0>/G<,1>周期阻滞而发生凋亡，起到杀伤肿瘤的作用。

目录

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摘要

引言

第一部分研究背景

1.食管癌概述

1.1食管癌的定义及流行病学

1.2食管癌的病因病机及组织病理学分型

1.3食管癌的治疗现状

2.黄药子概述

2.1黄药子的生长

2.2祖国医学对黄药子的认识

2.3黄药子的现代药理研究

3.细胞周期简述

3.1细胞凋亡

第二部分黄药子对Eca-109细胞增殖、诱导凋亡的影响

1材料与仪器

1.1细胞株

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4试剂的配制

2主要指标及实验方法

2.1对Eca-109细胞的抑制作用

2.2对诱导Eca-109细胞凋亡的作用

3实验结果

3.1Eca-109细胞生长曲线及倍增时间的测定

3.2Eca-109细胞形态观察

3.3黄药子提取物对Eca-109细胞增殖作用的影响

3.4Hoechst33342/PI的结果

3.5流式细胞仪检测

3.6黄药子提取物对Eca-109细胞凋亡的DNA Ladder检测

4讨论

4.1药物的选择

4.2肿瘤细胞生长及凋亡的相关研究及评价

4.3HYZ对Eca-109细胞抑制生长及诱导凋亡的作用机制

5结论

第三部分 结语

参考文献

附录

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致谢