桃拉综合症病毒和草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白抗体的制备与分析

摘要

水产动物病毒性疾病给水产养殖业带来了严重危害。桃拉综合症病毒(Ta ura syndrome virus,TSV)和草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)分别是感染南美白对虾和草鱼的主要病原,严重影响了其养殖业的健康发展,因此展开对这两种水产动物病毒结构蛋白的研究显得尤为必要。TSV隶属双顺反子病毒科(Dicistroviridae),蜜蜂麻痹病毒属(Aparavirus);其基因组大小约为10 kb,包含两个开放性阅读框架(ORF),ORF1编码非结构蛋白,ORF2编码三种结构蛋白:VP1,VP2,VP3。GC RV隶属呼肠孤病毒科,水生呼肠孤病毒属(Aquareov irus),其基因组共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。其中VP7是一种结构蛋白,由S10基因组片段编码,与VP5蛋白形成异源二聚体进而形成外壳蛋白层;VP7蛋白可以结合dsRNA,与病毒的细胞吸附有关。本研究对TSV结构蛋白基因vp2、vp3进行了克隆表达,并对结构蛋白VP2、VP3及 GCRV病毒外壳蛋白VP7进行了表达纯化、相应的多克隆及单克隆抗体的抗体制备,主要内容如下:
　　1.桃拉综合症病毒结构蛋白基因v p2、v p3的克隆表达及抗体制备
　　根据GeneBank中桃拉综合症病毒的全基因组序列,分别设计该病毒的主要结构蛋白基因v p2、v p3的对应引物,提取感染TSV的南美白对虾中的总RNA并以此为模板,利用RT-PCR技术对目的基因进行了扩增;将目的基因vp2和vp3分别克隆到表达载体pET-16b-1和pGEX-4t-3质粒中,并转化入Escherichia coli BL21(DE3)和DH5α中。经IPTG诱导和SDS-PAGE分析后,分别获得大小分别为42 kDa和48 kDa的重组蛋白VP2和VP3,且两种目的蛋白均以包涵体形式存在。将蛋白胶上目的蛋白条带割胶纯化并作为多抗制备的免疫原获得抗VP2血清(P-vp2)和抗VP3血清(P-vp3)。单克隆抗体的制备以合成的VP2及 VP3多肽为免疫原,经BALB/c小鼠免疫、细胞融合及克隆亚克隆筛选获得杂交瘤细胞,对培养上清液纯化后获得抗VP2单克隆抗体(M-vp2)和抗VP3单克隆抗体(M-vp3)。
　　Western blot分析显示四种均可与体外表达的蛋白发生特异性免疫反应,且与大肠杆菌中其他蛋白无交叉反应。Immunodot-blot结果显示两种多抗血清与两种单克隆抗体均可以从TS V感染的对虾中检测到 VP2蛋白和VP3蛋白;同时,单克隆抗体对TSV结构蛋白的特异性较多抗血清高;单克隆抗体M-vp2的效价较单克隆抗体M-vp3略高。该结果为TSV的免疫检测方法的建立提供了技术基础,为实现TSV的免疫学防控提供了可能。
　　2.草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7的表达及单克隆抗体的制备
　　将体外构建的VP7表达质粒转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中,经IPTG诱导后,获得重组蛋白VP7,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果显示VP7蛋白以包涵体形式存在。将蛋白胶上目的蛋白条带割胶纯化并作为多抗制备的免疫原获得抗VP7血清。采用体外微量中和实验分析该多抗血清的中和能力。无菌取免疫小鼠脾细胞与 SP2/0瘤细胞融合,经两次筛选及再克隆得到12株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过ELISA及Western blot方法筛选出最佳单抗株,获得GCRV病毒外壳蛋白VP7单抗株,制备单克隆抗体。采用辛酸饱和硫酸铵法对小鼠腹水及细胞培养上清液进行纯化并鉴定该单克隆抗体的亚型。
　　微量中和实验及病毒滴度实验结果证明该多抗血清能够特异性中和GC R V粒子,并且能够有效的阻止GCRV病毒的感染。ELISA及Western blot分析显示单克隆抗体对50 TCID50 GCRV病毒的最低检测浓度为0.737μg/ml,且对GST标签蛋白无交叉反应。抗体亚型鉴定结果显示该单克隆抗体的亚型为IgG2b。采用该抗体分别对采自不同地区的草鱼病样进行ELIS A检测,以RT-PCR检测法作为对照。对采集的草鱼出血病样品的ELIS A结果显示:样品检出阳性率与RT-PCR结果一致,该单抗对GC R V病原具有高度特异性和灵敏性,可用于GC RV的检测和结构蛋白分析。本研究制备的草鱼呼肠孤病毒单克隆抗体具有较好的特异性以及灵敏性,可用于草鱼呼肠孤病毒临床的免疫学检测,为GC R V的免疫检测技术研发提供了资料。同时,为以后对GC RV病毒与宿主之间的免疫反应以及对现有GC RV疫苗的评价提供了基础资料。

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引言

第一章 桃拉综合症病毒与草鱼呼肠孤病毒的研究概述

1桃拉综合症病毒研究概述

1.1对虾养殖中的主要病毒性疾病

1.2桃拉综合症病毒的发现

1.3桃拉综合症病毒的基因组结构与特征

1.4桃拉综合症病毒的检测方法

1.5 TSV的防治措施

2草鱼呼肠孤病毒的研究概述

2.1 鱼类主要的病毒性疾病

2.2草鱼呼肠孤病毒的发现

2.3草鱼呼肠孤病毒的基因组结构与特征

2.4草鱼呼肠孤病毒多肽的免疫原性研究

2.5 草鱼呼肠孤病毒的检测方法

2.6草鱼呼肠孤病毒的防治措施

第二章 桃拉综合症病毒结构蛋白VP2及VP3的克隆、表达及抗体的制备

1 材料与方法

1.1实验材料

1.2 病样的采集及前处理

1.3 桃拉综合症病毒RNA的提取及RT-PCR

1.4 重组表达载体的构建及表达

1.5多抗血清的制备

1.6单克隆抗体的制备[114]

1.7 Western Blot及ELISA分析

1.8 Immunodot Blot分析

2．结果与分析

2.1 v p2及v p3基因的克隆

2.2 表达载体的构建及重组子的鉴定

2.3 目的蛋白的表达及其可溶性分析

2.4 Western Blot检测多抗血清及单克隆抗体备

2.5 Immunodot Blot 检测

3．讨论

第三章 草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7的表达及其单克隆抗体的制备

1 材料与方法

1.1材料

1.2样品的采集与处理

1.3草鱼呼肠孤病毒宿主细胞的传代培养

1.4草鱼呼肠孤病毒的病毒扩增

1.5抗原制备

1.6 多克隆抗体及单克隆抗体的制备

1.7 草鱼出血病病灶组织上清过滤液中草鱼呼肠孤病毒的检测

2.2 多抗血清的微量中和效应

2．结果与分析

2.1 VP7蛋白的诱导表达及其多抗血清的制备

2.3 杂交瘤细胞筛选

2.4 单克隆抗体分型鉴定

2.5 单克隆抗体对临床标本的检测

3 讨论

结论

附录：论文发表情况

参考文献

致谢