常见的检疫性植物病毒高通量检测方法的建立和比较

摘要

植物病毒广泛存在于自然界,在寄主细胞内寄生生活,专一性强,影响植物的正常生长发育,造成农作物和经济作物减产甚至导致某种植物灭亡从而影响生态系统。植物病毒种类繁多,本文中南芥菜花叶病毒(Arabis mosaci virus, ArMV),烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表,番茄斑萎病毒属(Tospovirus)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)中唯一侵染植物的病毒属,代表种有番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus, INSV)和鸢尾花黄斑病毒(Irisyellow spot virus,IYSV)。
　　目前进境检疫口岸常用的植物病毒检测方法有血清学和分子生物学,其中血清学用于植物病毒的初筛,分子生物学由于检测灵敏度较高,用于病毒的进一步确定。然而,植物病毒在寄主体内分布不均,含量低,检测取样的局限性等因素会影响检测的灵敏度。本研究将保存的ArMV毒源添加到进境的百合种球中作为实验材料,进行免疫磁珠吸附和PEG沉淀两种不同的前处理方法,将经过两种不同前处理和未经任何前处理的实验材料进行反转录PCR扩增。实验结果表明前处理可以大大富集分布不均的植物病毒,提高检出率,在此实验中PEG沉淀富集的效果优于免疫磁珠吸附。
　　近几年,各口岸进境农作物不断增加,传统意义上的PCR检测灵敏度较高,通量低。本研究以Agdia公司购买的ToRSV和TRSV毒源, ArMV侵染的百合种球为实验材料,根据ArMV、ToRSV和TRSV的CP基因设计合成多对引物,进行筛选,优化反应条件,进行特异性和灵敏度验证。在此基础上进行多重PCR,优化多重PCR反应条件,分别扩增出ArMV438bp,TRSV300bp,ToRSV131bp的特异性片段,建立了同时检测百合种球中ArMV、TRSV和ToRSV的多重RT-PCR体系和SYBR-Green PCR体系,大大缩短了检测时间,简化了操作步骤,具有较强的应用价值,适合进境植物的快速检测,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。
　　本研究还通过聚苯乙烯荧光微球与病毒多抗交联,采用标记有生物素的另一配对单抗以及藻红蛋白标记的亲和素组成相应的荧光报告系统,用液相芯片仪Luminex200检测待检样本荧光强度,建立了TSWV、INSV及IYSV液相芯片高通量检测方法。实验结果表明能同时检测出这几种病毒而不发生交叉反应。将液相芯片与DAS-ELISA的检测灵敏度进行比较,结果表明液相芯片检测TSWV,INSV和IYSV的灵敏度高于DAS-ELISA1-2个稀释度。以IYSV血清为例,在2012年9月20日到2012年10月26日间进行重复性检测,共计5次,计算变异系数,其值均小于20％,说明该方法重复性较高。本实验建立的同时检测三种病毒的液相芯片方法为进一步建立其他检疫性病毒同步检测提供了技术支持,使液相芯片技术在病毒检测方面有着更广阔的应用前景。
　　本实验建立的同时检测三种病毒的液相芯片方法为进一步建立其他检疫性病毒同步检测提供了技术支持,使液相芯片技术在病毒检测方面有着更广阔的应用前景。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

第一章 文献综述

1.1 国内外植物病毒研究现状

1.2 进境植物中常见的六种检疫性病毒简介

1.3 植物病毒检测的前处理技术

1.4 植物病毒不同检测技术及研究进展

第二章 植物病毒前处理方法的建立和比较

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 百合常见病毒的多重检测

3.1 材料与设备

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 结论

第四章 三种番茄斑萎病毒属病毒的液相芯片检测

4.1 材料与方法

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 结果与讨论

参考文献

附录A：常用缩略语表

附录B：常用生化试剂、分子生物学试剂及仪器

附录C：主要试剂的配制

致谢