有机磷降解酶基因(opdA)在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中的表达与酶学研究

摘要

有机磷农药(organophosphates, OPs)具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点,在保护农作物免受病虫害侵染、提高粮食产量等方面发挥了巨大作用。但它们对人类的生存环境造成了严重的污染,并导致瓜果与蔬菜等农产品农药残留超标,直接危害人类与动物的健康。所以有机磷农药降解方面的研究在环境保护和食品安全方面受到了高度关注。
　　研究发现,一些能降解有机磷农药的降解菌的降解作用是通过产生有机磷降解酶来实现的。而直接使用此类有机磷降解酶降解有机磷农药的效率远高于使用产生此类酶的降解菌。
　　来源于土壤杆菌属Agrobacterium radiobacter P230的有机磷降解酶(OpdA)具有底物范围广和催化效率高的特点,因此被公认为是迄今为止最具有应用前景的有机磷降解酶。有机磷降解酶通过水解有机磷农药的磷脂键,最终实现有机磷农药的无毒化。本研究旨在利用已有的研究基础,建立有机磷降解酶基因(opdA)大肠杆菌表达系统,实现其高效表达;同时对枯草芽孢杆菌的电转化条件进行优化,建立高效的电转化方法,并构建有机磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢杆菌中的分泌表达系统,克服重组蛋白在大肠杆菌表达系统以包涵体的形式在胞质中形成造成重组蛋白复性困难这一难题。
　　1.有机磷降解酶基因(opdA)在大肠杆菌中的高效表达与酶学研究
　　使用限制性内切酶Xho I和BamHI双酶切目的片段与表达质粒,将扩增的opdA基因定向插入到原核表达载体pET-28b中,构建大肠杆菌表达载体pET-28b-opdA,并将其转化到E. coli BL21(DE3)中获得重组工程菌株,经IPTG诱导实现高效表达,并对重组菌株的诱导表达条件进行优化,实验结果是:诱导前菌液OD600的吸光值为0.5时,经1.25 mmol/L IPTG在37℃下诱导表达5h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白OpdA对甲基对硫磷的Km值为42.6μmol/L,其Vmax为32.669μmol/L·min。比酶活为24.48U/mg。
　　2.枯草芽孢杆菌电转化条件的优化研究
　　将穿梭质粒pHY300PLK电转化至枯草芽孢杆菌,对电转化条件GM培养基、EM培养基、RM培养基、电击时电场强度、质粒浓度进行优化。实验结果是:在GM-2培养基(LB+0.5 M sorbitol)、EM-6培养基(0.5 M sorbitol+0.5 M mannitol+10％Glycero)、RM-6(LB+0.5 M sorbitol+0.38 M mannitol)、电击电压为2.0KV、质粒浓度为100 ng/μl条件下,电转化率最高,枯草芽孢杆菌电转化率为1.45x103个/μg DNA。
　　3.有机磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达与酶学研究
　　利用人工合成方法的获得opdA基因,构建表达载体pHT43-opdA,并将其转化至枯草芽孢杆菌WB800N中获得重组工程菌株。实验结果是:诱导前菌液OD600的吸光值达到0.7时,经1.25 mmol/L的IPTG在37℃下诱导27h,实现高效分泌表达。蛋白酶活力检测结果是有机磷降解酶 OpdA酶活力为1.921U/ml,比酶活为107.94U/mg。有机磷降解酶OpdA对甲基对硫磷的Km值为44.2μmol/L,其Vmax为268.39μmol/L·min,kcat为648.29min-1。分泌表达的酶蛋白比之前报道的酶活力提高了0.9倍,实现了有机磷降解酶基因(opdA)的高效分泌表达。

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第一章 文献综述

1.1引 言

1.2降解有机磷农药的微生物及其降解酶的研究进展

1.3有机磷降解酶（OpdA）的简介

1.4有机磷降解酶OpdA的作用机理

1.5大肠杆菌表达系统的研究进展

1.6食品级表达系统

1.7枯草芽孢杆菌分泌表达系统的研究进展

1.8立文依据与研究内容

第二章 有机磷降解酶基因(opdA)在大肠杆菌中的高效表达与酶学研究

2.1引 言

2.2实验材料、仪器与试剂

2.3实验方法

2.4结果与分析

2.5讨论

第三章 枯草芽孢杆菌的电转化条件的优化研究

3.1引 言

3.2实验材料、仪器与试剂

3.3实验方法

3.4结果与分析

3.5讨论

第四章 有机磷降解酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达与酶学性质

4.1 引 言

4.2 实验材料、仪器与试剂

4.3实验方法

4.4 结果和分析

4.5讨论

全 文 小 结

参考文献

攻读硕士学位期间的论文及研究成果

致谢