纤溶活性化合物对蛋白质结晶特性影响的研究

摘要

蛋白质是生物学过程的重要组成部分,是生命活动的基础。用 X射线衍射法确定蛋白质的三维结构对理解大分子结构、药物的作用机制、改变或修饰分子结构并使之具有特定的应用特性等有十分重要的意义。血栓性疾病是威胁人类健康的主要疾患之一,临床上使用的大部分溶栓药品如肝素、阿昔单抗、尿激酶等会有出血性危险、过敏反应、特异性差等不良反应,因此,出血危险性小、不损伤血液因子、活性能够简单调控的溶栓药物亟需出现。海洋纤溶活性化合物GDG和FGFC1是经本研究室研究确定的低分子纤溶活性化合物,能增强纤溶系统中的纤溶活性。通过X射线衍射测定蛋白质结构的前提是获得适合X射线衍射结构分析的蛋白质单晶,然而,获得高质量的单晶是蛋白质结构确定的瓶颈。鸡蛋白溶菌酶(简称 HEWL)由于其稳定性,溶解性和易结晶性,已被结晶学家作为蛋白质结晶理论的模板而被广泛研究。
　　论文以HEWL结晶过程为例,研究不同的环境对其结晶行为的影响,研究纤溶活性化合物GDG和FGFC1对HEWL结晶特性的影响,并通过X-射线衍射在低温下收集了添加GDG的HEWL晶体的数据,并对其结构进行了解析;研究了GDG和FGFC1对纤溶因子尿激酶和链激酶的结晶影响。探索小分子化合物对大分子蛋白质的作用机制,为蛋白质构效关系和新型溶栓药物的设计与研制构建理论支持。
　　第一章归纳了20世纪以来人们对血栓性疾病的研究进展和新型溶栓药物的溶栓机制,生物制药与蛋白质组学的关系,利用同步辐射 X射线衍射确定蛋白质晶体结构的研究进展。主要是对血栓疾病的形成机制与血栓病危害,经典溶栓药物种类及特性,纤溶活性化合物的溶栓机制,蛋白质结晶与纤溶因子构象研究,同步辐射光源衍射确定蛋白质晶体结构的基本原理,溶菌酶的结晶特性研究进行了总结。目前临床上应用的抗血栓药物,大多数或因为注射给药、或因为不良反应严重而不能作为日常用药在长时期反复使用,因此研制有效、安全、适于长时期,甚至终生使用的口服抗血栓药物具有重大的意义。从海藻中获得的GDG和从海洋微生物中代谢产物中获得的FGFC1是一种小分子化合物,已经证实其具有促进血栓溶解的作用。本论文的研究目的是探索GDG和FGFC1对溶菌酶结晶特性的影响,利用同步辐射X射线衍射分析GDG和FGFC1与溶菌酶和纤溶因子的共结晶体三维空间结构,佐证针对确立的海洋纤溶活性化合物促进血栓溶解特性,从构象上研究纤溶活性化合物GDG和FGFC1对纤溶因子的影响,并对最终的GDG、FGFC1促进血栓溶解作用特性做出相应的补充和完善,发现小分子纤溶化合物作用新靶点及新药先导结构的优化。
　　第二章对溶菌酶的结晶条件进行了研究。主要介绍悬滴气相扩散法结晶的原理和方法,利用显微镜观察溶菌酶晶体的表观,筛选适合溶菌酶结晶的条件,并对筛选的结晶条件进行小范围的优化,确定溶菌酶结晶的最优条件,并分析结晶试剂、沉淀剂浓度、结晶溶液pH值、结晶温度对溶菌酶晶体生长的影响。确定了溶菌酶最优的结晶条件为:15mg/ml溶菌酶,在含5％氯化钠和0.02%叠氮化钠, pH值5.2的0.1 M醋酸钠缓冲溶液中,溶菌酶晶核数量较少,晶体尺寸最佳。
　　第三章研究纤溶活性化合物对溶菌酶结晶特性的影响。根据添加剂对蛋白质结晶的影响的基本理论,结合第二章筛选出的最优溶菌酶结晶条件,将纤溶化合物GDG和FGFC1添加到溶菌酶溶液中,研究GDG与FGFC1共结晶条件。得到晶体后对晶体进行显微镜观察,分析添加GDG和FGFC1的溶菌酶晶体的表观数据,分析纤溶化合物对溶菌酶结晶特性的影响。结果表明,GDG可能会影响溶菌酶结晶,在相同的结晶条件下,加入GDG可以促进晶核的形成。
　　第四章研究纤溶活性化合物对溶菌酶晶体结构的影响。基于第三章 GDG和FGFC1对溶菌酶结晶特性有影响,推测GDG和FGFC1可能影响了溶菌酶的分子结构,因此本章利用同步辐射X射线衍射GDG和FGFC1与溶菌酶的共结晶体,经衍射数据收集与还原,解析空间三维空间结构,以小分子作用于大分子蛋白质的机制为本章研究的理论基础,研究纤溶活性化合物对溶菌酶主链、侧链、催化域、活性位点的影响。
　　第五章是对纤溶活性化合物影响纤溶因子晶体结构的初步研究。目前本研究室已经发现海洋纤溶活性化合物GDG诱导纤溶因子构象改变和活性变化的关系及其促进血栓溶解的特性,有待进一步确定GDG是否提高了纤溶因子如纤溶酶(原)、纤溶酶原激活剂等纤溶因子的活性,确定GDG是否降低了纤溶酶原激活物抑制剂、纤溶酶抑制剂等的活性,发现GDG促进体内纤溶作用的机制。本章具体针对GDG对尿激酶型纤溶酶原激活剂、链激酶型纤溶酶原激活剂晶体结构做初步研究,利用悬滴结晶法研究GDG与尿激酶、链激酶的共结晶条件和结晶特性,但实验结果结晶条件不确定,有待进一步研究。

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第1章 引言

1.1 血栓性疾病的危害与形成机制

1.2 经典抗栓溶栓类别及特性

1.3 低分子溶栓化合物及其溶栓机制

1.4 同步辐射X射线衍射确定大分子结构与蛋白质结晶学的研究

1.5 纤溶因子构象研究进展

1.6溶菌酶的结晶特性及构象研究

1.7 研究目的与意义

第2章 溶菌酶结晶条件的研究

2.1 材料与方法

2.2 溶菌酶结晶条件的优化

2.3 影响溶菌酶晶体生长的因素分析

2.4 小结

第3章 纤溶活性化合物对溶菌酶结晶的影响

3.1 基本理论

3.2 材料与器材

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 小结

第4章 纤溶活性化合物影响溶菌酶晶体结构的研究

4.1 理论依据

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 小结

第5章 纤溶活性化合物影响纤溶因子晶体结构的初步研究

5.1 研究目的

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

第6章 总结与建议

6.1 论文总结

6.2 对未来工作的建议

参考文献

致谢