红景天多糖对猪MII期卵母细胞体外成熟及玻璃化冷冻的影响

摘要

本试验以屠宰场猪卵巢作为材料,主要研究红景天多糖(RSP)对猪卵母细胞体外成熟及玻璃化冷冻保存的影响,旨在优化猪卵母细胞体外成熟培养体系以及玻璃化冷冻方法,
　　结果表明:
　　(1)首先按照卵泡大小将卵母细胞分为4个组别:>6 mm、2-6 mm和<2 mm组。从直径2-6 mm卵泡中抽取的卵母细胞体外培养核成熟率(83.90±1.54％)和大卵泡(直径>6 mm)组(80.90±2.69%)无显著差异(P>0.05),但是都显著高于小卵泡(直径<2 mm)的核成熟率(47.03±4.72%,P<0.05)。
　　(2)比较不同体积成熟培养液对猪卵母细胞体外成熟效果的影响。于微滴(50μL)、250μL和500μL TCM199培养液中分别置15、35、65个猪卵母细胞进行体外成熟培养,观察核成熟情况,结果表明:250μL组的核成熟率(79.53±3.48%)与500μL组(79.71±5.91%)之间差异不显著(P>0.05),但是均显著过于微滴(50μL)组(65.41±6.28%,P<0.05)。
　　(3)红景天多糖(RSP)对猪卵母细胞体外成熟及发育潜力的影响。与对照组(83.50±1.00%)相比,添加0.6、6和60 mg·L-1的RSP均能提高其核成熟率,但差异不显著(P>0.05);6和60 mg·L-1的RSP组能显著提高卵母细胞内GSH含量(P<0.05),随着RSP浓度的增加可以降低ROS水平,但是各组之间差异不显著(P>0.05);孤雌激活中,60 mg·L-1 RSP组的卵裂率(88.44±5.06%)和6 mg·L-1 RSP的囊胚率(40.94±8.23%)最高,且显著高于对照组(72.16±7.38%和24.06±5.16%,P<0.05);与对照组(33.52±4.05%)相比,0.6、6和60 mg·L-1 RSP组体外受精卵裂率均显著提高(P<0.05),60 mg·L-1 RSP组的囊胚率达(19.20±3.13%),显著高于对照组的(9.60±0.65%,P<0.05)。
　　(4)本试验分别采用自制半麦管、OPS及麦管作为冷冻载体,用于猪MII期卵母细胞冷冻保存,比较冷冻效果,结果显示:半麦管法冷冻-解冻后卵母细胞形态正常率及存活率(87.36±1.93%,73.78±4.06%)稍高于 OPS法(84.37±3.49%,70.48±1.06%),两者之间差异不显著(P>0.05),但是显著高于麦管法(67.43±2.72%,54.40±3.80,P<0.05),表明采用自制半麦管作为冷冻载体冷冻猪卵母细胞具有较好的冷冻效果。
　　(5)为了提高猪成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果,本试验应用玻璃化快速冷冻仪(Vit-Master)装置进行猪成熟卵母细胞的冷冻,以观察其冷冻效果。结果显示:浆状液氮降温速率(21345±1768℃/min)远远高于普通液氮降温速率(11982±1936℃/min);各组冻后形态完整率无显著差异(P>0.05);在冻后存活率上,使用玻璃化快速冷东仪的不同浓度保护剂组(A’(57.87±10.66%)、B’(76.5±10.33%)、C’(79.07±14.90%)和D’(81.94±6.98%))均分别高于对应的不使用玻璃化快速冷冻仪组(A(49.73±2.91%)、B(60.63±12.45%)、C(71.33±14.38%)和D(78.50±7.40%)),但均无显著差异(P>0.05),B’和C’组均高于C和D组,但差异不显著(P>0.05),A和A’组均显著低于B’、 C’和D’组(P<0.05)。因此,通过使用Vi t–Master冷冻装置提高冷冻速率,可以降低冷冻保护剂使用浓度并提高冻后存活率。
　　(6)红景天多糖(RSP)对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻的影响。在猪卵母细胞成熟液中添加不同浓度RSP并将成熟培养44 h后的卵母细胞进行玻璃化冷冻,与对照组(72.44±2.64%,4.33±1.11%)相比,0.6、6、60 mg·L-1 RSP组解冻后卵母细胞成活率和孤雌激活卵裂率均有所提高,添加60 mg·L-1 RSP组孤雌激活卵裂率(8.68±2.08%)与对照组(4.33±1.11%)有显著差异(P<0.05)。同时在预处理液和冷冻液EDFS35分别添加不同浓度RSP,然后进行玻璃化冷冻保存,结果显示:无论是存活率还是卵裂率,随着RSP浓度的增加均有所提高,但是差异不显著。

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第一章 引 言

1.1 猪卵母细胞体外成熟的研究进展

1.1.1 猪卵母细胞发育与成熟

1.1.2 影响猪卵母细胞体外成熟的因素

1.2 卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展

1.2.1 卵母细胞冷冻的意义

1.2.2 玻璃化冷冻保存原理

1.2.3 卵母细胞玻璃化冷冻保护剂

1.2.4 冷冻保存方法

1.2.5 冷冻对卵母细胞的影响

第二章 红景天多糖对猪卵母细胞体外成熟及其发育的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 不同直径卵泡卵母细胞体外核成熟率的比较

2.2.2 不同体积培养液对猪卵母细胞体外成熟的影响

2.2.3 RSP对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

2.3 讨论

2.3.1 卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟的影响

2.3.2 培养液体积对猪卵母细胞体外成熟的影响

2.3.3 RSP对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

第三章 红景天多糖对猪卵母细胞玻璃化冷冻的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 自制冷冻载体对猪MII期卵母细胞冷冻效果的影响

3.2.2 不同浓度冷冻保护剂及降温速率对猪卵母细胞冷冻效果的影响

3.2.3 红景天多糖（RSP）对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻的影响

3.3 讨论

3.3.1 不同冷冻载体对猪MII期卵母细胞冷冻效果的影响

3.3.2 冷冻保护剂和降温速度对猪MII期卵母细胞冷冻效果的影响

3.3.3 RSP对猪MII期卵母细胞冷冻效果的研究

参考文献

图版说明

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致谢