cfGnRH基因敲除对斑点叉尾鮰繁殖能力的影响

摘要

基因编辑技术是进行基因功能研究的重要工具，类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术是近年来发展最为蓬勃的基因编辑技术之一。这种基因编辑技术以其适用范围广、操作较为简便、效率高、成本低等优点，已经在多种生物中成功运用，也在多种鱼类中进行了实践研究，例如斑马鱼（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）和黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco）等。基因编辑在改良品种，提高生产效率，治疗疾病等方面具有巨大的潜力。
　　斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）作为美国主要淡水养殖品种之一，近年来其养殖产业在运营成本增高，疾病种类剧增，其他进出口冷冻鱼等多种因素影响下受到了很大的挑战。利用基因编辑技术修改斑点叉尾鮰的基因组成可以极大地提高生产效率，然而，随之而来的问题是由于基因编辑鱼类的泄漏所带来的生态安全隐患。绝育技术可以有效地减小或避免这些隐患。本研究前期利用TALEN和二次电穿孔的技术，在受精卵时期敲除斑点叉尾鮰的鲶鱼型 GnRH（cfGnRH）基因获得P1代的父本和母本，当基因编辑的斑点叉尾鮰P1代3龄性成熟时，将其与野生型斑点叉尾鮰进行交配，获得F1子一代。本研究分别利用 P1代和 F1代斑点叉尾鮰为材料，检测了不同组织中cfGnRH基因突变的存在，比较了斑点叉尾鮰基因编辑型和野生型在产卵季节时的繁殖情况，评估了GnRH，雌二醇和睾丸素的分泌情况，以及F1代幼鱼的GnRH基因突变存在的情况，对构建基因编辑绝育生物以预防对生态环境潜在的不良影响具有重要意义。主要结果如下：
　　（1）性成熟率的统计。本实验利用二次电穿孔的技术对实验组和对照组的400个卵子和相应的受精卵进行电转。实验组的卵子和受精卵被电转入TALEN质粒，对照组的卵子和受精卵不被电转入 TALEN质粒。本研究在实验组的斑点叉尾鮰P1代达到3龄时，对其进行性成熟率的统计。产卵季节时，性成熟的雌鱼腹部膨大柔软并且有弹性，生殖孔红肿，微向外突出。性成熟的雄鱼一般体色较深，生殖乳头大且硬，头部肌肉发达。实验组被分为突变型鱼和非突变型鱼，突变型的鱼在分子鉴定中被发现其基因组DNA的cfGnRH基因位点存在突变现象；反之，非突变型的鱼没有被发现有靶向cfGnRH基因位点的突变现象。统计结果发现，在相同条件下的循环系统中，突变型斑点叉尾鮰中只有31.25％的鱼具备性成熟特征，而非突变型斑点叉尾鮰中有83.33%的鱼具备性成熟特征。突变型雌鱼的性成熟率（20%）略低于雄鱼（36%）；非突变型雌鱼的性成熟率（100%）略高于雄鱼（75%）。这可能是由于突变型的斑点叉尾鮰被敲除了cfGnRH基因，影响了性腺发育。由于性腺发育依赖于性激素的规律性脉冲，雌鱼对于脉冲的规律性和强度要求可能更加苛刻，因而突变型的雌鱼的性腺发育受到的影响更大。
　　（2）突变存在分子检测。本研究在斑点叉尾鮰P1代达到3龄时，随机抽取突变型斑点叉尾鮰5尾，非突变型斑点叉尾鮰6尾，以及野生型斑点叉尾鮰4尾，取腹鳍和胡须为样品，利用Surveyor? Mutation Detection试剂盒（IA）检测基因突变现象。结果发现，每条鱼3龄时的突变现象检测结果与其6月龄时的突变现象检测结果完全一致。因此，随着时间的迁移，基因突变的情况没有改变，可以认为基因编辑技术所产生的基因突变可以稳定存在。突变的稳定存在能够确保斑点叉尾鮰在生长过程中保持cfGnRH基因的转录始终受到影响，从而使得基因功能长久受到影响，进而抑制性腺的发育与成熟以及配子的产生。
　　（3）配对产卵。配对产卵实验中的第一阶段，共选取了3龄的具有性成熟特征的7尾突变型雄鱼，1尾非突变型雄鱼，4尾突变型雌鱼以及1尾非突变型雌鱼，分别与野生型斑点叉尾鮰进行交配产卵（野生型♀×突变型♂，野生型♀×非突变型♂，突变型♀×野生型♂，非突变型♀×野生型♂），只有野生型的雌鱼被注射LHRHa荷尔蒙催产。第二阶段，突变型和非突变型的雌鱼也被注射LHRHa荷尔蒙催产。第三阶段，将2尾突变型的雌鱼分别与1尾突变型的雄鱼和1尾非突变型的雄鱼进行配对（突变型♀×突变型♂，突变型♀×非突变型♂）；将1尾非突变型的雌鱼与1尾突变型的雄鱼进行配对（非突变型♀×突变型♂），所有的雌鱼和雄鱼都被注射了LHRHa荷尔蒙催产。除此之外，5对野生型斑点叉尾鮰被两两配对，置于独立的透明鱼缸中进行自然产卵实验，不注射任何荷尔蒙，以设置对照组。实验结果表明，与突变型斑点叉尾鮰配对的野生型雌鱼的产卵率为42.9%，略低于对照组（60%），受精卵的孵化率显著低于对照组；突变型雌鱼产卵率为25%，显著低于对照组（60%）；5-8号突变型雄鱼的生殖行为异常。这可能是由于cfGnRH基因的敲除阻碍了突变型雌鱼的性腺发育，使其无法顺利产卵。并且， cfGnRH基因的敲除改变了突变型雄鱼的生殖行为，从而不能给予雌鱼正常的繁殖信号，不能引发野生型雌鱼正常排卵。
　　（4）激素水平检测。本研究利用酶联免疫吸附实验技术对P1代3龄的6尾野生型斑点叉尾鮰，12尾突变型斑点叉尾鮰以及8尾非突变型斑点叉尾鮰进行检测。本实验利用鱼的雌二醇ELISA试剂盒对所有雌鱼进行检测，通用生物睾丸素ELISA试剂盒对所有雄鱼进行检测，以及鱼的GnRH ELISA试剂盒对所有鱼进行检测。实验的结果表明，没有参与产卵实验的突变型和非突变型的斑点叉尾鮰的雌二醇和GnRH的激素水平没有显著差别，突变型的斑点叉尾鮰的雌二醇和 GnRH的激素水平的平均值略高于非突变型的斑点叉尾鮰。参与产卵实验但并未产卵或授精的斑点叉尾鮰中，不同组别的雌二醇和 GnRH的激素水平没有显著差别，野生型斑点叉尾鮰的这2种激素水平的平均值略高于突变型和非突变型的鱼。参与产卵实验且产卵或授精的斑点叉尾鮰中，不同组别的睾丸素和GnRH的激素水平没有显著差别，野生型斑点叉尾鮰的睾丸素水平的平均值略高于突变型和非突变型的鱼。这可能是因为P1代实验组的受精卵存在马赛克现象，并且斑点叉尾鮰体内还有另一种形式的GnRH的存在，因此，雌二醇和睾丸素这些类固醇类激素可能通过其他内分泌通道被调节和释放，并且有可能受到负反馈的调节，其激素水平反而增多。8号突变型雄鱼的GnRH水平很低，并且在产卵实验中未顺利授精，很有可能为绝育的鱼。10号突变型雌鱼的雌二醇水平很低，并且在产卵实验中未产卵，很有可能为绝育的鱼。
　　（5）F1代的CEL-I突变结果检测实验。配对实验中，有4尾野生型的雌鱼产卵，她们分别与编号为1-4的突变型或非突变型雄鱼配对，有1尾编号为9的突变型的雌鱼在与野生型雄鱼配对过程中产卵，由此，获得了5个家系的F1代受精卵。本研究以斑点叉尾鮰F1代为实验材料，通过CEL-I实验分析基因突变情况，并且与父本或母本进行比较。实验结果表明，5个家系的F1代幼鱼的基因突变情况与其突变型父本或母本相一致。同一条幼鱼的不同部位的检测样品的突变检测结果相一致。因此，F1代幼鱼不存在马赛克现象，有更大的可能性达到绝育的目的。

目录

声明

第一章 引 言

1.1基因修饰鱼面临的问题

1.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术在鱼类研究中的应用

1.3 GnRH基因的分类，结构和功能

1.4 研究内容及意义

第二章 cfGnRH基因敲除斑点叉尾鮰的性成熟情况

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 cfGnRH基因敲除鱼P1代的分子鉴定

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

第四章 cfGnRH基因敲除对P1代成鱼排卵、授精能力和荷尔蒙分泌的影响以及F1代幼鱼的分子鉴定

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

小结

参考文献

硕士期间发表论文与参加会议

致谢