海水养殖鱼哈维弧菌分离株多位点序列分析及耐药谱型研究

摘要

哈维弧菌（Vibrio harveyi）是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于海水养殖环境，能够在有利条件下感染水产动物，引起宿主复杂多样的临床致病症状，造成非常高的死亡率，给水产养殖经济产业带来巨大打击。然而，此菌与其类似菌种如坎氏弧菌、副溶血弧菌等具有极其高的表型和基因型相似度，对其进行准确的鉴定分型存在诸多困难。此外，对该菌的耐药谱型特点进行研究可为流行病学调查和合理用药提供指导，是许多研究者目前关注的重点。本研究利用多位点序列分析法对采集自2007-2012年我国南方沿海地区患病海水鱼的哈维弧菌分离株进行鉴定分型，探究多基因位点序列对哈维弧菌类似群的区分力及哈维弧菌分离株多基因位点分型情况。采用K-B法对鉴定的哈维弧菌分离株进行12种抗生素的敏感性实验，研究其耐药谱型特点，运用耐药性情况SPSS聚类分析进一步对哈维弧菌分离株进行分型，探究分型的菌株的耐药性特征。结果如下：
　　1.利用6个保守基因位点16S rRNA、mreB、rctB、rpoD、topA、toxR分别对210株采样分离株进行测序鉴定。通过PCR、测序比对得到95株哈维弧菌类似群菌株，7株创伤弧菌菌株；基因序列的进化分析和系统进化树构建表明，除toxR基因外，其余基因在进化过程中均存在基因重组事件，系统进化树中不能将哈维弧菌类似群菌株完全区分；各基因序列在哈维弧菌种内遗传相似度分别为99.1~100％（16S rRNA）、91.1~100%（mreB）、98.5~100%（rctB）、87.1~100%（rpoD）、86.6～100%（topA）、98.4～100%（toxR），在哈维弧菌类似群菌株间的种间遗传相似度依次为98.4～99.9%（16S rRNA）（不包括V. communis）、87.0~98.4%（mreB）、73.2～98.9%（rctB）、80.8~100%（rpoD）、75.9~100%（topA）、24.4～78.9%（toxR）；基因的区分力为，毒力蛋白编码基因toxR＞保守蛋白编码基因（mreB、rctB、rpoD、topA）＞16S rRNA。
　　2.基于串联基因序列进化分析及构建系统进化树发现，串联基因序列分析能够降低重组基因事件的影响，将哈维弧菌类似菌株在系统进化树中有效的分支，其中rctB-toxR基因的串联在进化树中的分支结果与mreB-rctB-rpoD-topA-toxR串联的一致，均能最好的将哈维弧菌类似群菌株区分，最终获得哈维弧菌分支包括84株分离株，占分离株的40.0%；V. communis分支含有2株分离株（0.95%）；2株分离株聚为副溶血弧菌；4株分离株归为轮虫弧菌（1.9%）；3株分离株鉴定为溶藻弧菌（1.4%）。
　　3.基于5基因（mreB-rctB-rpoD-topA-toxR）串联分析的哈维弧菌分离株分型情况发现，84株哈维弧菌分为a-k共11个亚支，各亚支菌株来源分布各有特点，其中，a、b、c亚支均只有一株，分别分离自2010、2011年广东地区养殖的患病卵形鲳鲹及2011年福建地区养殖的患病红鳍笛鲷；d亚支含有18株分离株，占21.4%，其石斑鱼分离株均分离至海南地区，而卵形鲳鲹及点篮子鱼分离株均来源于广东地区；e亚支的6株菌株均分离自患病的卵形鲳鲹；f亚支的7株分离株均采集于2011年；g亚支的4株分离株全部来自广东地区；聚为h亚支的15株分离株包含的宿主种类多达7种（包括4种不同的石斑鱼种类）；i亚支包括参考菌株V. harveyi ATCC33868与尖吻鲈分离株104CCL；j亚支由2株红鳍笛鲷分离株、8株石斑鱼分离株、标准株V. harveyi ATCC14126、参考株V. harveyi LMG4044构成；k亚支包括20株分离株，占23.8%，从采集地域看，4株广西地区分离株均聚在该亚支中，从采集的年份看，2010年的分离株（除72BKI外）亦均聚在该亚支，2012年的菌株仅有1株分布于此分支中，从分离的宿主看，该亚支90.0%（18株）的菌株从石斑鱼上获得。可见，来源不同的分离株可以聚落为同一亚支，相同来源的分离株也可以分布在不同的亚支中，这表明来源不同的哈维弧菌分离株可以具有相似的基因型，来源相同的哈维弧菌分离株的基因型存在差异。
　　4.哈维弧菌菌株的12种抗生素耐药性实验结果表明，哈维弧菌分离株有A-Z共26种耐药谱型，谱型丰富度为31.0%；多重耐药谱型数量（耐药种数3种以上）为13种，占总耐药谱型数量的50.0%，谱型丰富度达59.1%。海南、广东、广西、福建的分离株分别包含有18种、15种、3种、1种耐药谱型，四个地区均具有J型（FUR/AMO）耐药谱；2007-2012年的分离株耐药谱型及耐药抗生素种类依次为J、M（耐2种抗生素），A、B、J、M（耐5种抗生素），除Y、Z外的A-X耐药谱型（耐7种抗生素），包括Y、Z耐药谱型（耐8种抗生素）；青石斑鱼、棕点石斑鱼、鳃棘鲈、卵形鲳鯵、珍珠龙趸分离株的耐药谱型数量为6-10种，其余宿主的分离株耐药谱型数量仅为1-3种。聚类分析先将实验菌株分为i-vi共6个亚群，进而聚类为GroupI、GroupII两个组群；各亚群菌株具有独特的耐药谱型，耐药谱型分别是N、P、T、U、Y（i亚群），R、S（ii亚群），K、P（iii亚群），F、H、O、X、V、W（iv亚群），E、G、Q（v亚群），C、L、Z（vi亚群）；两个组群菌株没有共同的耐药谱型。
　　5.比较哈维弧菌菌株耐药谱分型与基因分型的结果发现，在耐药谱型中聚类为同一亚群的菌株在进化树分支中可以处于不同的亚支，在进化树中聚为同一亚支的菌株也具有多种耐药谱型，这说明两种分型方法的结果没有明显的一致性。

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第一章 引 言

1. 哈维弧菌概况

1.1 哈维弧菌分类地位及命名

1.2 哈维弧菌生物学特性及分布

1.3 哈维弧菌流行病学及致病性

1.4 哈维弧菌防治及耐药谱

2 哈维类似群（V. harveyi clades）的分子鉴定及分型研究进展

2.1 哈维类似群

2.2 哈维弧菌类似群的分子鉴定方法

2.3哈维弧菌类似群的分子分型方法

3 本论文研究目的和意义

第二章 哈维弧菌单基因位点序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 受试菌株的活化及纯化

2.2.2 PCR扩增及电泳检测

2.2.3 测序及BLAST结果

2.2.4系统进化树构建

2.2.5 基因序列进化分析

2.3 讨论

第三章 哈维弧菌串联基因位点序列分析

3.1材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 串联基因的多态性情况

3.2.2 串联基因序列的遗传距离情况

3.2.3 基因区分力情况

3.2.4 串联基因构建的系统进化树

3.2.5 基于5基因串联分析的哈维弧菌分离株分型情况

3.3 讨论

第四章 哈维弧菌分离株耐药谱型研究

4.1 材料及方法

4.1.1菌株来源

4.1.2 药物敏感性实验

4.1.3 哈维弧菌耐药谱分析

4.1.4 基于耐药谱的哈维弧菌分型

4.1.5相关名词解释

4.2 结果

4.2.1哈维弧菌的耐药谱

4.2.2基于耐药谱的哈维弧菌分型

4.3讨论

4.3.1 哈维弧菌耐药情况

4.3.2 哈维弧菌耐药性与来源相关性分析

4.3.3 基于耐药谱的哈维弧菌的分型分析

4.3.4 菌株耐药谱分型与基因分型的相关性分析

总结

参考文献

附录

致谢