脊尾白虾免疫相关基因的克隆和表达分析

摘要

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)具有繁殖能力强、生长季节长、环境适应性广的特点，是我国重要的底栖虾类。近年来随着我国沿海滩涂地区的开发，脊尾白虾已经成为我国重要的经济养殖品种，其人工养殖的规模发展迅速，养殖面积已超过20万亩，养殖产量已占我国东部沿海混养池塘总产量的1/3，成为黄渤海沿海滩涂地区主要的特色水产养殖品种。但随着养殖面积的扩大，病害问题也日益严重起来，给养殖户造成了严重的经济损失。对脊尾白虾免疫相关基因的研究，有助于深入研究脊尾白虾病原防御机制，理解其作用机理，从而有助于提高脊尾白虾抗病能力，更好的完成病害防治的过程为脊尾白虾抗病品种选育及大规模养殖提供理论依据。
　　本研究在本实验室构建的脊尾白虾血细胞cDNA文库获得了脊尾白虾α2-巨球蛋白基因EST序列，采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA end, RACE）技术克隆获得脊尾白虾α2-巨球蛋白基因cDNA全长，命名为Ecα2M基因。该基因全长4823bp，由4413bp的开放阅读框，64bp的5'端非编码区，以及346bp的3'端非编码区组成，开放阅读框编码1470个氨基酸，分子量为163.0 kDa，理论等电点为5.03。序列分析表明，Ecα2M序列N端含有23个氨基酸组成的信号肽。同源性分析表明，脊尾白虾 Ecα2M基因氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)α2M的同源性最高，达到80％。荧光定量PCR分析结果表明，Ecα2M基因在血细胞、肝胰腺、肌肉、鳃、卵巢、眼柄、胃及肠中均有表达，其中在血细胞当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后3h和6h，脊尾白虾血细胞和肝胰腺中 Ecα2M的表达量较对照组均极显著增加(P<0.05)，且具有明显的时间差异性。本研究结果表明Ecα2M基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用。
　　采用RACE技术克隆获得脊尾白虾14-3-3基因cDNA全长，命名为Ec14-3-3。该基因全长2905bp，包含744bp的开放阅读框，127bp的5'端非编码区(UTR)以及2033bp的3'端非编码区。，开放阅读框编码247个氨基酸组成的蛋白质，分子量为27.95 kDa，理论等电点为4.65。同源性分析表明，脊尾白虾Ec14-3-3基因氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高，达到98％。荧光定量PCR分析结果表明，Ecα2M基因在血细胞、肝胰腺、肌肉、鳃、卵巢、眼柄、胃及肠中均有表达，其中在血细胞当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6h，脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3的表达量较对照组均极显著增加(P<0.05)，且具有明显的时间差异性。本研究结果表明 Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用。
　　采用 RACE技术克隆获得脊尾白虾 C-型凝集素基因 cDNA全长，命名为EcCTL。该基因全长全长1285bp，包含1041bp的开放阅读框，62bp的5'端非编码区(UTR)以及182bp的3'端非编码区。，开放阅读框编码346个氨基酸组成的蛋白质，分子量为38.56kDa，理论等电点为4.29。同源性分析表明，脊尾白虾EcCTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高，达到91％。荧光定量PCR分析结果表明，EcCTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉、鳃、卵巢、眼柄、胃及肠中均有表达，其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6-12h，脊尾白虾血细胞和肝胰腺中 EcCTL的表达量较对照组均极显著增加(P<0.05)，且具有明显的时间差异性。本研究结果表明 EcCTL基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用。

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引言

1 脊尾白虾病害及免疫研究

1.1研究背景

1.2 主要病原微生物

1.3 脊尾白虾研究概况

2 α2-巨球蛋白研究进展

2.1 α2-巨球蛋白分子结构

2.2 α2-巨球蛋白研究进展

3 14-3-3研究进展

3.1 14-3-3蛋白结构特性

3.2 14-3-3基因的功能研究

4C型凝集素研究进展

4.1 C-型凝集素的结构特征

4.2 C-型凝集素功能研究

5 选题依据和研究目的及意义

5.1 选题依据

5.2 研究目的及意义

第一章 脊尾白虾α2-巨球蛋白(Ecα2M)基因的克隆与表达分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要化学试剂及仪器设备

1.3 实验方法

1.4 序列分析

1.5 Ecα2M基因的表达分析

2 结果

2.1 Ecα2M基因cDNA全长的克隆及序列分析

2.2 Ecα2M基因的相似性及系统进化分析

2.3 Ecα2M基因的组织表达分析

3 讨论

第二章 脊尾白虾14-3-3(Ec14-3-3)基因的克隆与表达分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要化学试剂及仪器设备

1.3 实验方法

1.4 序列分析

1.5 Ec14-3-3基因的表达分析

2 结果

2.1 Ec14-3-3基因cDNA全长的克隆及序列分析

2.2 Ec14-3-3基因的相似性及系统进化分析

2.3 Ec14-3-3基因的组织表达分析

3 讨论

第三章 脊尾白虾C-型凝集素(EcCTL)基因的克隆与表达分析

1材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要化学试剂及仪器设备

1.3 实验方法

1.4 序列分析

1.5 EcCTL基因的表达分析

2. 结果

2.1 EcCTL基因cDNA全长的克隆及序列分析

2.2 EcCTL基因的相似性及系统进化分析

2.3 EcCTL基因的组织表达分析

3 讨论

参考文献

硕士期间论文发表情况

致谢