鲤鱼保种群体遗传结构与感染CyHV-3的转录组研究

摘要

随着人类对鲤鱼的需求增加，高密度集约化养殖成为了主要养殖方式，但这种养殖方式一旦发病就会出现大规模的感染或死亡，严重影响了鲤鱼产业的健康、稳定和可持续发展。而药物方法除治疗效果甚微外对生态环境也造成污染，因而对鲤感染 CyHV-3的转录组研究的抗病育种成为从根本上解决问题有效手段。伴随着分子育种技术的不断完善，使得鱼类新品种不断问世，而对了其种质资源的保护工作就显得捉襟见肘跟不上速度。在微卫星以及 SNP等分子标记手段在鱼类群体遗传学方面的应用早已成熟的前提下，对鱼类保种群体方面的研究甚少。因此加大保种群体遗传结构的研究来确保育种基础的稳定后，再进一步进行抗病育种从而从根本上解决疾病对水产养殖业的危害。
　　应用35对多态性较高的微卫星标记对鲤鱼新品种——松浦红镜鲤的保种群体进行了遗传结构研究。结果显示：在91尾松浦红镜鲤个体中，共检测到140个等位基因，每个位点等位基因数3～6个，平均等有效位基因数为3.0426；期望杂合度范围为0.3750～0.8274，均值为0.6493；多态信息含量范围为0.396～0.912，均值为0.5869；哈迪-温伯格平衡检验结果群体处于不平衡状态；平均固定系数为-0.026，说明该群体存在杂合子过剩现象；瓶颈效应分析表明，群体已经历了瓶颈效应；根据连锁不平衡方法计算有效群体大小为31.2。该研究表明松浦红镜鲤遗传多样性较为丰富，为了在下一步保种工作中避免或降低瓶颈效应应加强保护工作，从而保持其丰富多样性和优良的经济性状。
　　利用20个微卫星标记对国内仅存的两个散鳞镜鲤(Cyprinus carpio)保种群体(SP、CJ)进行遗传多样性分析。结果表明：20个微卫星标记共检测到147个等位基因，平均值为7.35，有效等位基因数（Ae）、期望杂合度（He）以及多态信息含量（PIC）的平均值分别为2.7828、0.6041和0.5386。SP群体的Ae、He以及PIC值分别为3.1126、0.6479和0.5948，其值均大于 CJ群体（2.4529、0.5602和0.4823）。在两个群体中，群体特有等位基因共53个，其中9个为低频等位基因。对20个引物在两个群体中等位基因进行显著性分析，结果表明其中有16个引物可以作为区分两个群体的特异性分子标记。瓶颈效应分析结果显示2个群体均经历了瓶颈效应。同胞率检测结果（SP，97.5％；CJ，96.7%）偏高说明群体内近交压力较大。哈迪温伯格平衡检测表明：两个群体大部分位点偏离平衡并处于杂合子过剩状态。两个群体间的遗传距离(D)为0.5625，个体聚类结果显示，SP群体和CJ群体的个体均各聚为一支。群体间的遗传分化指数(Fst)为0.1138，Nm值为1.9462。该研究表明散鳞镜鲤群体遗传多样性水平较高，其中 SP群体的遗传多样性水平高于CJ群体，且两群体处于中度遗传分化。
　　感病组和未感病组转录组进行深度测序，得到显著差异表达基因：以未发病鱼为对照，发病轻度与未发病鱼显著差异表达基因4488个，其中上调基因1162个，下调基因3326个；发病中等程度与未发病鱼显著差异表达基因5411，其中上调基因965个，下调基因4446个；发病严重鱼与未发病鱼显著差异表达基因4954个，其中上调基因1375个，下调基因3579个。在三个比较中，发病中等程度与未发病鱼显著差异表达的基因最多，但上调基因数最少。而差异表达基因主要富集到15个显著差异信号通路，分别为 Amoebiasis、Jak-STAT signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、Chemokine signaling pathway、Fc gamma R-mediated phagocytosis、Natural killer cell mediated cytotoxicity、Toxoplasmosis、Lysosome、Shigellosis、Pathways in cancer、Adherens junction、Chronic myeloid leukemia、Measles Protein processing in endoplasmic reticulum、Antigen processing and presentation。用荧光定量PCR验证其中6个极显著的信号通路，结果均出现显著差异性。同时从转录水平上进行抗病相关SNP挖掘，筛选到与抗病相关SNP标记3214个。

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第一章引 言

1.1微卫星在鲤鱼群体遗传学方面的应用

1.1.1遗传多样性的研究

1.1.2微卫星在遗传结构方面的研究

1.1.3在进化方面的研究

1.1.4亲权鉴定

1.1.5展望

1.2鲤鱼免疫基因以及其SNP的研究

1.2.1鲤鱼的免疫基因的克隆

1.2.2免疫基因表达调控情况

1.2.3免疫基因多态性研究情况

1.2.4 SNP开发情况

1.2.5鲤免疫基因SNP与抗病关联性研究

1.2.6展望

第二章鲤鱼保种群体遗传结构

2.1松浦红镜鲤保种群体的遗传结构

2.1.1 材料与方法

2.1.2结果与分析

2.1.3 讨论

2.2散鳞镜鲤两个保种群体的遗传多样性

2.2.1 材料与方法

2.2.2结果

2.2.3讨论

第三章鲤感染CyHV-3的转录组研究

3.1材料和方法

3.1.1 试验组织

3.1.2 试验主要试剂和仪器

3.1.3方法

3.2结果

3.2.1差异表达基因及SNP结果

3.2.2 显著差异信号通路

3.2.3显著信号通路的验证

3.3讨论

3.3.1荧光定量内参基因的选择

3.3.2荧光定量数据处理

3.3.3荧光定量结果分析

3.3.4 SNP大批量挖掘的意义

小结与展望

参考文献

致谢

在校期间论文发表情况