橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代耐盐相关基因的研究

摘要

罗非鱼隶属于鲈形目、丽鱼科，大多数为广盐性种类，既可以在淡水中养殖，驯化后也可在咸水中生长。罗非鱼的耐盐性机理非常复杂，涉及到生理、生态、环境和遗传因子等各个方面。TRPV4、催乳素Ⅰ（PRLⅠ）和Na+-K+-ATPase alpha1亚基（NKAα1）等是与耐盐渗透调节密切相关的基因。本文以橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）、荷那龙罗非鱼（O. hornorum）及其正反交子代为实验材料，在耐盐性能比较的基础上，对上述三个基因的序列组成、分子结构及转录后 mRNA表达差异进行了系统的研究，以期从分子水平探索4种罗非鱼的耐盐差异，为耐盐罗非鱼新品种的选育和推广提供理论基础。主要研究结果如下：
　　1、橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的正反交子代耐盐性能的比较
　　通过急性耐盐实验比较了橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的正反交子代的耐盐性差异，结果表明：正交子代（莫荷罗非鱼）和反交子代（荷莫罗非鱼）的96h半致死盐度（MLS-96）分别为29.80±3.03‰和29.38±4.48‰，两者没有显著差异，两个杂交子代具有明显的的杂种优势，其耐盐性高于两个亲本。
　　2、橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代三种耐盐相关基因的克隆和序列分析
　　采用同源克隆方法克隆了橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代的TRPV4、催乳素Ⅰ（PRLⅠ）和NKAα1基因，并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析。结果表明，4种罗非鱼的TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因序列长度分别为3198bp、798bp和3165bp，ORF分别长2613bp、639bp和3072bp，编码氨基酸数分别为870、212和1024个。用ClustalX2.0软件对三个基因核苷酸和氨基酸序列进行比对，结果表明：4种罗非鱼 TRPV4基因完全一致；橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼PRLⅠ氨基酸序列仅在31号位点存在一个氨基酸残基差异，正反交子代各有一个同源片段在此处为亮氨酸（Leu，L），与橙色莫桑比克罗非鱼一致，而两者另一同源片段在此处均为苯丙氨酸（Phe，F），与荷那龙罗非鱼一致；两亲本的NKAα1基因完全一致，荷莫罗非鱼的一个同源片段和莫荷罗非鱼与两亲本比相差一个氨基酸。用MEGA5.1构建系统发育树结果显示：橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代TRPV4基因和PRLⅠ基因与其它罗非鱼首先聚为一支，再与其他鲈形目鱼类聚为一支，在一定程度上反映出了生物进化的关系；橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代NKAα1基因与莫桑比克罗非鱼亲缘关系更近，而合鳃目与鲤形目的三种淡水鱼聚为一支，暗示着NKAα1基因的进化可能与鱼类耐盐性相关。
　　3、橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代耐盐相关基因的mRNA表达差异
　　3.1 TRPV4基因的mRNA表达差异
　　橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼TRPV4基因表达量相对较高的几个组织是垂体、肝、皮肤、鳃、心脏，在各组织中的表达量整体上比较低，均小于0.005。橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代在22‰的水体中TRPV4基因表达量有所下降，且在鳃和肾中这种变化更明显，在35‰的海水中橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代TRPV4基因表达量有所回升，荷那龙罗非鱼的肾和莫桑比克罗非鱼的肌肉中TRPV4基因表达量在35‰的海水中甚至都超出了淡水中的水平，可以看出TRPV4基因的表达与环境的渗透压有关。
　　3.2 PRLⅠ基因的mRNA表达差异
　　橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼 PRLⅠ基因在垂体中的表达量最高，在其他组织中的表达量较低，可以推测垂体是罗非鱼 PRLⅠ基因的主要表达场所。盐胁迫后橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代垂体中的PRLⅠmRNA水平均显著降低，肌肉中两亲本和它们的正反交子代 PRLⅠ基因表达量的变化趋势与垂体中类似，其mRNA水平降低的过程更缓和。由此可知PRLⅠ基因是参与罗非鱼渗透压调节的重要基因，是罗非鱼淡水适应的重要因素。
　　3.3 NKAα1基因的mRNA表达差异
　　橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼肾和肠中NKAα1基因的表达量最高，尽管鳃中NKAα1基因的表达水平低于肾和肠，但在盐胁迫条件下橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代鳃中NKAα1基因的表达量增加最明显。可以看出Na+-K+-ATPase与鱼类渗透压调节密切相关。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

1 罗非鱼简介

1.1 罗非鱼概述

1.2 我国的罗非鱼养殖状况

1.3 不同种类罗非鱼的耐盐性

2 鱼类耐盐相关基因的研究进展

2.1 TRPV4基因

2.2 催乳素基因

2.3 Na+-K+-ATPase基因

3 本论文研究目的与意义

第一章 橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼正反交子代耐盐性的初步研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 耐盐实验设计

1.4耐盐指标分析方法

2 结果分析

2.1 莫荷罗非鱼和荷莫罗非鱼的急性耐盐实验

3 讨论

第二章 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因的cDNA克隆和序列分析

2.2 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因氨基酸序列分析

2.3 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1信号肽预测

2.4 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1氨基酸多重比对及系统发育树的构建

2.5 TRPV4和NKAα1蛋白质亲疏水性分析和跨膜区预测

2.6 TRPV4和NKAα1蛋白质磷酸化位点分析

2.7 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1蛋白质的高级结构预测

3 讨论

3.1 TRPV4与TRP通道家族其他成员的共同结构

3.2 PRLⅠ基因的保守结构

3.3 氨基酸残基磷酸化对NKAα1基因分子结构的影响

第三章 TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因的组织分布及表达分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 零盐度下橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼和尼罗罗非鱼TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因的组织表达

2.2 盐胁迫下橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代和尼罗罗非鱼TRPV4、PRLⅠ和NKAα1基因的表达分析

3讨论

3.1 TRPV4基因作为离子通道参与渗透压调节

3.2 PRLⅠ基因的渗透压调节作用

3.3 NKAα1基因是维持渗透压平衡的重要离子转运器

总结

参考文献

附录

致谢