橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼Ghrelin和GHSR基因的克隆及组织表达研究

摘要

生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)属于G蛋白偶联受体家族成员，是生长激素促分泌素(Ghrelin)的一种新发现的受体。研究表明，Ghrelin与其受体GHSR结合后，具有促进生长激素分泌，促进摄食，调节体重，并参与能量平衡的调节等生理功能。本实验通过对莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼Ghrelin/GHSR基因结构、功能及其组织分布和饥饿对Ghrelin和GHSR mRNA表达量的影响的研究，探讨罗非鱼生长发育的调控机制，为培育快速生长的罗非鱼养殖品种提供理论依据。 本实验采用RT-PCR技术从荷那龙罗非鱼胃总RNA中扩增得到Ghrelin cDNA全序列，对其进行序列测定和分析，结果表明荷那龙罗非鱼Ghrelin cDNA总长833bp，开放阅读框(ORF)为324bp，编码107个氨基酸的前体蛋白。其中包括22个氨基酸的成熟肽。成熟肽氨基酸序列GSSFLSPSQKPQNKVKSSRI，成熟肽N-末端第3位氨基酸为丝氨酸，和其他已知脊椎动物该基因位点上的氨基酸类别相同。采用半定量RT-PCR方法检测雌、雄荷那龙罗非鱼胃、肌肉和垂体等组织中Ghrelin基因的表达，结果显示，荷那龙罗非鱼Ghrelin基因有广泛的组织分布，Ghrelin基因在雌、雄鱼胃中的表达量均最高，在其它组织的表达量存在雌雄个体差异。雌鱼肌肉中Ghrelin基因的表达量明显高于雄鱼，是雄鱼的132倍。为了进一步研究Ghrelin基因的表达在荷那龙罗非鱼体内受能量水平的影响，实验鱼饥饿4周后，采用荧光定量RT-PCR方法检测胃中Ghrelin基因表达量变化，结果表明：饥饿组较对照组Ghrelin mRNA表达量有增加，饥饿组个体中Ghrelin基因表达量最高的个体的表达量比对照组中表达量最低的个体增加了47.3倍。 采用RT-PCR和RACE技术从莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼垂体总RNA中扩增得到GHSR cDNA全序列，结果发现罗非鱼GHSR基因存在两条cDNA链，命名为GHSR-1a和GHSR-1b，这一结果与其他动物研究结论一致。莫桑比克罗非鱼mGHSR-1a序列全长1627bp，编码385个氨基酸；mGHSR-1b序列全长1858bp，编码299个氨基酸。荷那龙罗非鱼hGHSR-1a序列全长1630bp，编码385个氨基酸；hGttSR-1b序列全长1861bp，编码299个氨基酸。 为进一步了解罗非鱼GHSR基因表达的调控方式，采用RT-PCR和基因组步移技术获得了罗非鱼GHSR基因的5’侧翼序列。其中莫桑比克罗非鱼的长为1627bp，荷那龙罗非鱼的长为1616bp。序列分析表明：罗非鱼GHSR基因5’转录调控区不含TATA盒，与黑鲷、人的GHSR基因5’侧翼区域有很多相同的转录调控元件，同时具有自身特有的转录调控元件。 利用荧光定量PCR方法检测了莫桑比克罗非鱼Ghrelin基因及其受体GHSR-1amRNA水平的组织表达以及饥饿对其表达的影响。结果表明：正常生理条件下，两基因在所检测组织中均有表达，但存在明显的组织差异。Ghrelin主要由胃中分泌，除了性腺外，所有被检测的组织雌鱼体内表达量高于雄鱼体内表达量，以肌肉中Ghrelin基因的表达差异最大，雌鱼是雄鱼的30.4倍。GHSR-1a在莫桑比克罗非鱼垂体、肝脏、心脏中表达量较高，且被检测的组织中雄鱼的表达量均高于雌鱼体内的表达量，其中鳃组织的表达差异最大，雄鱼是雌鱼的36.3倍。饥饿4周后罗非鱼胃中Ghrelin基因表达增加，雄鱼Ghrelin基因分泌量增加较雌鱼略高，雄鱼增加了3.65倍，雌鱼增加了2.63倍；GHSR-1a的表达量较正常组也略有变化，垂体中GHSR-1a的分泌量雌雄均下降，雄鱼饥饿组较正常组下降了0.336倍，雌鱼下降了0.156倍。说明ghrelin/GHSR-1a系统具有调节莫桑比克罗非鱼能量平衡的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1 罗非鱼研究现状

2生长激素促分泌素(Ghrelin)研究进展

2.1 Ghrelin的发现

2.2 蛋白质及基因结构

2.3 Ghrelin在组织中的分布

2.4 Ghrelin的作用机制和功能研究

2.5 Ghrelin的应用前景展望

3生长激素促分泌素受体(GHSR)研究进展

3.1 GHSR的结构

3.2 GHSR的组织分布

3.3 GHSR的功能

4本论文研究的目的意义

5本论文的思路和技术路线

5.1 罗非鱼Ghrelin和GHSR的cDNA及基因组序列的克隆及序列分析

5.2 罗非鱼Ghrelin及其受体基因GHSR-1a的组织表达

第二章　荷那龙罗非鱼Ghrelin cDNA序列的克隆及组织表达

1 材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 荷那龙罗非鱼胃总RNA的检测

2.2荷那龙罗非鱼Ghrelin cDNA全序列克隆

2.3 荷那龙罗非鱼Ghrelin基因的序列分析

2.4荷那龙罗非鱼Ghrelin基因的组织表达

2.5定量PCR分析饥饿对荷那龙罗非鱼Ghrelin基因表达的影响

3讨论

3.1 荷那龙罗非鱼Ghrelin基因序列分析

3.2荷那龙罗非鱼Ghrelin组织差异表达分析

3.3饥饿对荷那龙罗非鱼Ghrelin mRNA表达的影响

结论

第三章 橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼GHSR基因5’侧翼序列的克隆

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1 PCR扩增产物电泳图

2.2橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼GHSR基因启动子中转录调控元件分析

3讨论

第四章 橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼GHSR cDNA全序列克隆

1材料和方法

1.1实验材料

1.2方法

2结果

2.1 橙色莫桑比克罗非鱼垂体总RNA的检测

2.2橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼GHSR cDNA核心片段的扩增

2.3 橙色莫桑比克罗非鱼GHSR cDNA 5'RACE扩增

2.4 橙色莫桑比克罗非鱼GHSR cDNA 3'RACE扩增

2.5 橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼GHSR cDNA序列

2.6 GHSR ORF区核酸序列及编码氨基酸的同源性比较

3讨论

第五章橙色莫桑比克罗非鱼Ghrelin cGHSR-1a组织分布及饥饿对其表达量的影响

1材料和方法

1.1实验材料

1.2方法

2结果

2.1 橙色莫桑比克罗非鱼各组织RNA的检测

2.2 双标准曲线的建立结果

2.3 橙色莫桑比克罗非鱼Ghrelin/GHSR组织分布

2.4饥饿对橙色莫桑比克罗非鱼Ghrelin/GHSR mRNA表达量的影响

3讨论

3.1 Ghrelin组织表达分析

3.2 cGHSR-1a组织表达分析

3.3 饥饿对橙色莫桑比克罗非鱼ghrelin及其受体GHSR-1a表达的影响

小结

全文总结

参考文献

致谢

附录一 缩略词表

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