密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

摘要

志贺氏菌是细菌性痢疾的主要病原体，一般感染10-100个志贺式菌就能使人发病，全世界每年的感染人数可达到1.6亿，其中发展中国家的死亡病例高达90％以上。志贺氏菌传播的主要途径是粪口，其可以入侵炎症上皮细胞，导致脓肿和溃疡等强烈的炎症反应。
　　近年来，微生物群体间的相互作用越来越引起人们的关注，细菌所表现出的细胞相互作用，如抗生素的产生、菌体自身的发育及孢子的形成等，都需要高密度细胞共同协作完成。而密度感应系统是细菌间重要的交流系统，可通过细菌密度来调控这些协作行为。
　　据研究显示，在基因组水平上，大肠杆菌和志贺氏菌存在同源性和相似性，但两者在表型及致病性方面表现出较大的差异。通过对比两种菌的基因序列发现：在两者的基因序列中，都含有密度感应系统操纵子基因，但两者存在一定差异。与大肠杆菌体内的密度感应系统相比，志贺氏菌体内缺少了密度感应系统的某些基因，如lsrK，lsrB，lsrF。
　　本研究利用传统的酶切连接法构建了密度感应系统缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK，利用Golden Gate克隆法构建了完整密度感应系统回复株301/pET28a-lsrKG。测定了弗氏2a志贺菌301野生株，301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG的生长曲线，比较它们在生长方面的差异；将两种不同细菌混合培养，通过菌落计数，分析判断缺失基因回复后对细菌生长优势的影响；制备野生株301、301/pPro-lsrBFK与301/pET28a-lsrKG的蛋白样品，进行双向凝胶电泳，比较野生株301、301/pPro-lsrBFK与301/pET28a-lsrKG的蛋白图谱并寻找差异蛋白点，经质谱鉴定得到差异蛋白点的信息，分析差异蛋白的可能作用。有关实验的详细结果，综合如下：
　　1．利用酶切连接法和Golden Gate克隆法成功构建了密度感应系统缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK和完整密度感应系统回复株301/pET28a-lsrKG。
　　2．利用哈氏弧菌BB170对信号分子AI-2生物发光的特性，检测弗氏2a志贺菌301可以向胞外释放并分泌有活性的信号分子 AI-2，并使哈氏弧菌BB170产生荧光。
　　3．301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG与野生株301相比，在生长曲线上没有较大差别，但301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG菌株在稳定期达到的细菌密度更大。
　　4．对301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG，野生株301，MG1655进行混合培养，通过菌落计数计算其生长比例，其结果表明：缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK与野生株301相比，不具有生长优势；而完整基因簇回复株301/pET28a-lsrKG与野生株301相比，具有较明显的生长优势。
　　5．利用双向凝胶电泳和质谱技术，对比301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG和野生株301的全菌蛋白双向凝胶电泳图谱，运用比较蛋白质组学分析差异蛋白点。结果表明：缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK相对于野生株301来说，蛋白差异点不明显；完整基因回复株301/pET28a-lsrKG相对于野生株301的蛋白图谱分析，两者存在多个蛋白差异点。其中比较重要的蛋白差异点有：密度感应系统中信号分子的转运蛋白LsrB蛋白；与蛋白折叠相关的分子伴侣蛋白GroEL；与代谢相关的酶类，如icdA编码的异柠檬酸脱氢酶、sdhA编码的琥珀酸脱氢酶，以及与电子传递链相关的氧化还原酶，如fabI编码的NADH还原型辅酶、nuoI编码的NADH脱氢酶等。

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第一章 引言

1. 1志贺氏菌的简介

1.2 志贺氏菌致病的毒力基因

1.3密度感应系统的简介

1.4密度感应系统信号分子在细菌中的类型

1.5 密度感应系统信号分子的化学组成分类

1.6 本研究的目的和意义

第二章 弗氏2a志贺菌密度感应系统缺失基因回复株的构建及其功能研究

2.1 研究背景

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第三章 弗氏2a志贺菌密度感应系统完整基因回复株的构建及其功能研究

3.1 研究背景

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

附录2 实验中所用仪器设备

附录3 实验中所用试剂

附录4 各种试剂盒使用步骤