抗基孔肯亚病毒单克隆抗体人源化及真核细胞高效表达研究

摘要

该研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞中表达具有中和活性的抗基孔肯亚(chikungunya,Chik)病毒的嵌合抗体,以图为Chik病的治疗提供被动免疫制剂.为表达嵌合抗体,首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)V<,L>和V<,H>基因及人IgGl亚类的C<,H>和C<,K>基因,通过融合PCR构建了抗Chik病毒的完整人-鼠嵌合抗体基因.将人-鼠嵌合抗体基因克隆到表达载体的多克隆位点(mutiple cloning site,MCS),构建了恒定区(constant region,C区)为cDNA序列的表达质粒.将构建的嵌合抗体表达质粒转染CHO/dhfr<'->细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选,获得最高表达量为2μg/ml的细胞株.对此细胞株扩大培养并纯化抗Chik病毒的嵌合抗体.纯化的嵌合抗体在非还原SDS-PAGE中表现为一条约150kD的带,在还原SDS-PAGE中表现为一条约50kD和一条约25kD的带;Western印迹结果显示,全分子蛋白和重链(heavy chain,H链)分子均可与羊抗人IgG Fc发生特异性免疫反应;全分子蛋白和轻链(light chain,L链)分子均可与羊抗人Kappa发生特异性免疫反应.用间接免疫荧光实验(indirect immunofloresence assay,IFA)检测显示,纯化的嵌合抗体与Chik病毒抗原发生强反应,说明表达的嵌合抗体保留了亲本鼠源McAb的抗原结合活性.用不同浓度的纯化嵌合抗体和鼠源McAb进行微量细胞中和实验,结果25μg/ml的嵌合抗体和15μg/ml的鼠源McAb可以保护细胞不出现病变,说明嵌合抗体具有与鼠源McAb相同的生物学活性.为了提高嵌合抗体的表达量,我们尝试用Flp-In<'TM>系统表达嵌合抗体,获得表达量为1μg/ml的稳定表达细胞株.遗憾的是此系统不能进行基因扩增,基于此,我们构建了在染色体的转录活性位点整合了FRT序列的CHO/dhfr<'->细胞株,命名为CHO/dhfr<'->FRT<'+>.在此细胞株中,表达了抗Chik病毒的嵌合抗体,通过MTX加压筛选,获得表达量为5μg/ml的稳定表达细胞株,是Flp-In<'TM>表达系统的5倍,是CHO/dhfr<'->表达系统的2.5倍.有报道称,C<,K>基因组序列能改善抗体在CHO细胞中的表达.但未见C<,H>基因组序列是否较cDNA序列表达量高的报道.因此克隆人抗体分子IgGl亚类C<,H>区基因组序列并构建了C区为基因组序列的双基因表达质粒,用Flp-In<'TM>系统研究了C区为cDNA序列和基因组序列对抗体表达量的差异,结果显示C<,H>区使用cDNA序列是基因组序列抗体表达量的3倍.

目录

引言

第一部分抗基孔肯亚(Chik)病毒人-鼠嵌合抗体基因的克隆及序列分析

第二部分抗Chik病毒嵌合抗体表达质粒的构建

第三部分抗Chik病毒嵌合抗体的表达、纯化和活性研究

第四部分用定点整合系统表达抗Chik病毒嵌合抗体的研究

第五部分用Flp-InTM系统研究抗体基因结构对表达量的影响

结论

参考文献

附录一主要溶液的配制

附录二主要缩略语表

论著一抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

综述一细胞内抗体应用的研究进展

综述二嵌合抗体及其在哺乳动物细胞中的表达研究进展

个人简历

致谢