尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工杂交卵子、精子相关的生物学特性研究

摘要

为培育罗非鱼耐盐养殖新品种，上海海洋大学通过种间杂交方法获得了兼具生长快和耐盐性强的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）♀×萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron）♂杂交种。然而，该杂交为属间远缘杂交，不能自然繁殖；罗非鱼为非同步性产卵鱼类，且卵子成熟时期不易掌控，难以获得批量成熟卵子进行人工授精，因而，其规模化制种难度大。为此，本论文通过对繁殖期尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼卵子、精子形态发育特征进行观察，比较了几种环境因子对精子活力的影响；以及尼罗罗非鱼卵巢成熟发育过程中性类固醇激素、卵黄蛋白原（Vitellogenin）含量及其mRNA表达变化特征分析，以期为尼萨罗非鱼杂交制种技术完善提供一定的基础资料。
　　繁殖季节，采用挤压亲鱼腹部方法获得了尼罗罗非鱼卵子、萨罗罗非鱼精子。用光学显微镜和解剖镜对各期卵子形态进行观察、拍照，比较分析不同成熟阶段卵子形状、卵径、表面色泽及卵黄颗粒积累特征，结果表明，未成熟卵细胞呈椭圆形，表层布满细长血管；成熟卵细胞似梨形，卵径为0.5～1.6mm，表层有透明卵膜，充满金黄色卵黄颗粒；过成熟卵细胞形状极不规则，卵黄颗粒开始液化。用扫描电镜对萨罗罗非鱼精子外形特征进行观察，正常精子由头部、中片及尾部组成，头部呈长锥状，长径1.82±0.35μm，宽径1.41±0.34μm；中片近圆柱形、较短，长径0.74±0.08μm，宽径0.16±0.06μm；尾部极长，16.42±0.35μm，单鞭毛结构。同时，还观察到短尾、双头、双尾三种异常类型的精子。
　　利用显微镜观察比较不同梯度的pH、盐度、离子以及葡萄糖条件下，萨罗罗非鱼精子活力（精子快速运动、寿命时间及激活率）的变化。结果表明：pH7.5～8.0时，精子激活率最高，达90％；pH7.5时，精子快速运动和寿命时间最长，为66.33±2.25s和933.17±25.79s。盐度25‰～32‰时，精子激活率最高，均达80%；30‰盐度时，精子快速运动和寿命时间最长，为63.50±2.35s和402.50±7.31s。随K+浓度增加，精子激活率和活力逐渐增强，75mmol/L时达峰值，然后快速下降。Ca2+对精子活力起明显的抑制作用，37.8mmol/L时精子活力最佳，而后随Ca2+浓度增高，精子抑制作用和聚集程度明显加重。与离子影响不同，葡萄糖可有效延长精子寿命，150mmol/L时，寿命时间仍为281.00±5.90s；125mmol/L以下时，激活率均为80%。
　　通过组织切片、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法，研究了尼罗罗非鱼卵巢自然成熟发育过程中性类固醇激素（雌二醇E2、孕酮P）、卵黄蛋白原（Vtg）含量及Vtg mRNA相对表达水平的变化规律。结果表明，尼罗罗非鱼性腺指数（GSI）与卵巢成熟发育间呈同步性变化，Ⅴ期达到峰值。血清中E2含量自卵巢Ⅱ期开始显著升高，Ⅳ期达到峰值，Ⅴ期后显著下降；血清P含量自卵巢Ⅱ期开始不断升高，Ⅴ期达到峰值，Ⅵ期显著下降；E2、P分别在卵巢成熟发育前期与后期发挥作用。肝中Vtg含量先升、后降，Ⅳ期达峰值；血清、卵巢中Vtg含量均自Ⅱ期开始增加，Ⅴ期达峰值，Ⅵ期显著降低。肝中Vtg mRNA表达水平在Ⅲ期达到峰值，Ⅳ期后持续下调；卵巢中Vtg mRNA表达水平相对较低，Ⅴ期达到峰值；初步推测肝、卵巢同为尼罗罗非鱼Vtg合成部位，肝是Vtg合成的主要器官，在卵黄积累阶段最为活跃，而卵巢Vtg合成水平相对较低。

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第一章 引 言

1.1 罗非鱼杂交育种

1.2 罗非鱼性腺发育和配子发生

1.3 本研究的目的和意义

第二章 尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工杂交中卵子、精子形态观察

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 pH、盐度及K+、Ca2+和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 尼罗罗非鱼卵巢成熟过程中性类固醇激素、卵黄蛋白原含量及其mRNA表达变化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

小结

参考文献

硕士在读期间发表论文

致谢