萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)及其杂交后代耐盐相关基因的研究

摘要

萨罗罗非鱼是一种耐盐性极强的罗非鱼品种，自然分布于西非从象牙海岸到塞内加尔的港湾、泻湖等广大水域。尼罗罗非鱼新吉富品系是在吉富的基础上群体选育而成的新品种，耐盐性弱，在淡水中具有生长速度快的优点。两者在分类上不同属，自然条件下不能交配，为了充分利用我国丰富的咸、海水资源，本研究室通过人工繁殖获得杂交后代，具有较好的生长速度和较强的耐盐性能的优点。Na+-K+-ATPase酶alpha1亚基(NKAa1)、Na+/K+-2Cl共转运子1 alpha亚基(NKCC1a)、胰岛素样生长因子-1b亚基(IGF-Ⅰb)和催乳素-Ⅰ基因(PRL-Ⅰ)等是与耐盐渗透调节密切相关的基因，本文以萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交F1为实验材料，在耐盐性能比较的基础上，对上述四个基因的序列组成、分子结构及转录后mRNA表达差异进行了比较系统的研究，以期对萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼的耐盐遗传机理进行有益的探索，为耐盐罗非鱼新品种的选育和推广提供必要的理论支持。主要研究结果如下:
　　一萨罗、尼罗及杂交F1耐盐性能的比较
　　以萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1及杂交F2为实验材料，从淡水零盐度开始，实验组每天提高水体8个盐度，直到实验鱼全部死亡，对四种遗传型罗非鱼的累积存活率(CS)和50％死亡盐度(MLS)进行比较，结果表明:(1)经过15天的慢性耐盐实验，萨罗罗非鱼的MLS约为125.78±1.66，尼罗罗非鱼的MLS约为54.22±2.51，杂交F1和F2的MLS值分别约为77.33±1.89和73.73±1.32。萨罗罗非鱼耐盐性能显著高于尼罗罗非鱼及杂交后代，而杂交后代耐盐性能也显著高于尼罗罗非鱼，杂交F1与F2之间的耐盐性能没有显著差异。(2)萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交后代第一尾鱼死亡的盐度分别为96、40和56，到最后一尾鱼死亡时盐度分别为136，80和96，间隔时间分别为6天、5天和5天。
　　二萨罗、尼罗及杂交F1 NKAa1基因克隆、序列分析及mRNA表达差异
　　根据GenBank中莫桑比克罗非鱼的NKAa1基因序列设计了1对引物，通过PCR扩增获得萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1 NKAa1基因的部分保守序列，根据所获得的序列，设计了6对RACE引物，分别进行3'RACE扩增和5'RACE扩增，得到萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1 NKAa1基因cDNA全长序列;设计一对qRT-PCR引物，用SYBR荧光染料检测其mRNA表达差异。实验结果表明:(1)萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1 NKAa1基因cDNA序列全长分别为3227bp、3257bp和3223bp，萨罗罗非鱼和尼罗罗非鱼核苷酸相似度为95.76％，与杂交F1相似度为97.73％，而尼罗罗非鱼与杂交F1相似度为93.92％。开放阅读框（ORF）长度为3072bp，编码1023个氨基酸，萨罗罗非鱼与杂交F1的氨基酸相似度为98.3％，尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼及杂交F1氨基酸相似度均为97.65％。(2)聚类分析表明杂交F1 NKAa1基因比较偏向于萨罗罗非鱼。(3)萨罗罗非鱼Ser519不同于尼罗罗非鱼和杂交F1，导致该位点附近NKAa1基因蛋白质二级结构发生了改变;萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1 NKAa1基因含8个跨膜螺旋结构域(TM)，其中TM1～4和TM7～8在所有同源物种中的分布都非常保守，但是TM5～6的分布差异较大，尼罗罗非鱼F916和T917两个氨基酸残基的突变，可能是其跨膜螺旋分布差异的原因。(4)淡水条件下，NKAa1基因在尼罗罗非鱼肝脏中的表达量最高，在肠道中表达量最低;而萨罗罗非鱼鳃、肠、肾中表达量显著的高于肝，杂交F1也是肠道中表达量最低，但是差异不显著;在致死盐度下，尼罗罗非鱼鳃和肠组织中NKAa1 mRNA表达量显著上升，而肝组织和肾组织中表达量则显著下降，萨罗罗非鱼鳃中NKAa1 mRNA的表达受盐度影响极其显著，致死盐度下鳃NKAa1表达量(19.821±3.951)接近为淡水条件下表达量(1.054±0.185)的20倍，杂交F1鳃肝肠肾中表达量均随着盐度上升而增加，但是差异不显著。
　　三萨罗、尼罗及杂交F1NKCC1a基因克隆、序列分析及mRNA表达差异
　　Na-K-2Cl1alpha亚基是维持鳃丝氯细胞渗透压平衡的关键离子转运器，以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例进行电中性跨膜转运。本文关于NKCC1a基因的研究结果如下:(1)从萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1鳃丝组织中分离出NKCC1α基因cDNA全长序列，全长分别为3832bp、3819bp和3827bp，其开放阅读框长3456bp，编码1151个氨基酸残基。多重比对和聚类分析结果表明，本研究获得的基因序列与莫桑比克罗非鱼、鲑及鳗鲡的NKCC1α最为相似，其中，与莫桑比克罗非鱼相似性最高(＞99％)。(2)预测萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交F1的NKCC1α蛋白质二级结构包含10个跨膜螺旋，这些跨膜螺旋的氨基酸序列及其分布在所有硬骨鱼类中都非常保守。(3)应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测鳃、肝、肠、肾NKCC1αmRNA相对含量，淡水条件下，萨罗罗非鱼鳃中的相对表达量最高，显著高于肝、肠和肾中的表达量;尼罗罗非鱼和杂交F1是肾脏中相对表达量最高，差异极其显著;盐度显著影响NKCC1α在萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交F1鳃组织中的表达，在致死盐度下NKCC1αmRNA相对表达水平分别为0盐度下的4.9倍、13.9倍和8.8倍，差异极显著(P＜0.001)，显示NKCC1α基因与三种遗传型罗非鱼耐盐适应密切相关。(4)在肠组织中，尼罗罗非鱼的NKCC1a基因mRNA相对表达量随盐度增加而显著升高，杂交F1则恰好相反，结果说明在高渗环境中它们可能具有不同的渗透压调节机制，尼罗罗非鱼更接近淡水鱼类的调节模式。(5)萨罗罗非鱼与杂交F1三个突变氨基酸残基位点S252、L398和M409导致其空间结构与尼罗罗非鱼不一致，可能与三者的耐盐差异有关。
　　四萨罗、尼罗及杂交F1IGF-Ⅰb基因克隆、序列分析及mRNA表达差异
　　应用3' RACE克隆技术，分别从萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1的鳃的总RNA中获得其IGF-Ⅰb基因的部分cDNA序列，对三种遗传型罗非鱼的IGF-Ⅰb基因的研究结果表明:(1)IGF-Ⅰb基因序列长度分别为1076bp、1075bp和1079bp，包含完整的开放阅读框(ORF)546bp、一个终止密码及含polyA信号的3'UTR，尚缺5'UTR序列;其ORF编码182个氨基酸，包括信号肽(44aa)，成熟肽B区(29aa)、C区(10aa)、A区(21aa)、D区(8aa)及编码70aa的E区，二级结构分析为混合类型。(2)同源基因多重比对表明，三种遗传型罗非鱼的IGF-Ⅰb基因与其他脊椎动物IGF-Ⅰb基因序列的相似度达75.8％～100％。成熟肽A、B区高度保守，C区第82位后缺失2aa， E区第131位和159位分别缺失3aa和1aa;(3)萨罗罗非鱼在E肽133位发生Ala/Pro氨基酸残基替换，与耐盐性强的莫桑比克罗非鱼和画眉罗非鱼一致，推测IGF-Ⅰb基因E区选择性剪切与三种罗非鱼耐盐性能差异有关。(4)淡水条件下，萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼和杂交F1 IGF-Ⅰb基因都是主要在肝脏中表达，但是在致死盐度下，耐盐性弱的尼罗罗非鱼肠道中含量最高，且极显著的高于淡水零盐度下表达量，而鳃、肝、肾中相对含量均显著降低;杂交F1和耐盐性强的萨罗罗非鱼在致死盐度下鳃中的含量均显著升高，但是杂交F1肝、肠、肾中含量均显著降低。
　　五萨罗、尼罗及杂交F1 IPRL-Ⅰ基因克隆、序列分析及mRNA表达差异
　　采用常规基因克隆和RACE相结合，从萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1鳃组织中得到PRL-Ⅰ基因cDNA部分序列，对三种遗传型罗非鱼的PRL-Ⅰ基因编码区的序列结构及mRNA表达进行分析，结果表明:(1)本研究得到萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼及杂交F1的PRL-Ⅰ部分cDNA核苷酸序列分别为1444bp、1449bp和1499bp，包括较短的5'UTR序列、保守的编码区和比较长的3'UTR序列。开放阅读框序列长639bp，编码212个氨基酸和一个终止密码(TAA)，编码区包括信号肽(24aa)和成熟肽(188aa)。(2)序列比对显示萨罗罗非鱼与杂交F1的ORF组成完全一致，二者与尼罗罗非鱼氨基酸相似度为99.5％，尼罗罗非鱼第2号（R2）和第46号(S46)残基发生突变，可能与它们的耐盐性能差异有关。(3)成熟肽的4个半胱氨酸残基在所有物种中都高度保守，同源比对结果显示，E29、M132、K140和L186等四个氨基酸残基为罗非鱼鱼类的特异性残基。(4) PRL-Ⅰ基因在鳃、肝、肠、肾组织中都有表达，淡水条件下尼罗罗非鱼肠中的含量最低，但是与其它三种组织中的表达量相比差异不显著;而萨罗罗非鱼以肝和肠中含量最高，与鳃和肾之间有显著差异;杂交F1肝中的含量极显著高于鳃、肠和肾。(5)在致死盐度下，尼罗罗非鱼肠道中mRNA相对含量达到淡水条件下的30倍，肝脏中含量也显著上升;萨罗罗非鱼鳃中的含量在致死盐度下比在淡水条件下显著升高;杂交F1在鳃中的含量前后变化不明显，在肝和肠中含量显著下降，但是在肾中的含量却显著升高，结果显示三种遗传型罗非鱼的PRL-Ⅰ在不同盐度下有不同的调节模式。

目录

声明

摘要

引言

第一章 尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交F1慢性耐盐致死研究

1 材料与方法

1．1 试验鱼

1．2 试验地点和容器设备

1．3 参数检测

1．4 试验过程

1．5 统计分析方法

2 结果

2．1 可测指标

2．2 耐盐行为

2．3 外形观察

2．4 MLS和CS统计分析

3．讨论

3．1 实验材料的独特性

3．2 耐盐指标和方法的选择

3．3 耐盐梯度参数设置

3．4 耐盐性能的应用

第二章 NKAa1，NKCC1a，IGF-Ib和PRL-I 基因克隆与序列分析

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

1．3 3`RACE扩增

1．4 5`RACE扩增

1．5 序列测定与分析

2 结果

2．1 RNA检测

2．2 基因保守区域CDS扩增结果

2．3 3`RACE扩增结果

2．4 5`RACE扩增结果

2．5 cDNA全长序列拼接结果

2．6 开放阅读框氨基酸序列比对

3 讨论

3．1 耐盐相关基因的选择

3．2 NKAα1基因碱基和氨基酸差异

3．3 NKCC1a基因碱基和氨基酸差异

3．4 IGF-I基因碱基和氨基酸差异

3．5 PRL-I基因碱基和氨基酸差异

第三章 耐盐相关基因生物信息学分析

第一节 NKAα 1基因

1 核苷酸分析

2 氨基酸分析

第二节 NKCC1a 基因

1 核苷酸分析

2 氨基酸分析

第三节 IGF-Ib基因

1 核苷酸分析

2 氨基酸分析

第四节 PRL-I基因

1 核苷酸分析

2 氨基酸分析

第五节 讨论

1 氨基酸残基磷酸化对NKAa1基因和NKCC1 a基因分子结构的影响

2 NKAa1基因拓扑膜结构多样性

3 NKCC1a基因功能结构域的差异分析

4 三种遗传型罗非鱼IGF-Ib基因的特定结构

5 PRL- I基因低渗调节功能

第四章 NKAa1，NKCC1a，IGF-Ib和PRL-I 基因m RNA表达研究

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果

2．1 cDNA 样品检测结果

2．2 标准曲线制备结果

2．3 NKAa1基因mRNA表达

2．4 NKCC1a基因mRNA表达

2．5 IGF-Ib基因mRNA表达

2．6 PRL-I 基因mRNA表达

3 讨论

3．1 关于相对定量分析的标准品选择

3．2 不同条件下四个基因的mRNA组织表达规律

第五章 小结

一 课题结论

二 主要创新点

三 下一步构想

参考文献

文献综述 罗非鱼类耐盐性研究

附录

致谢